JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:58 min. • July 8th, 2025
Peptydy penetrujące komórki, CPP, krótkie, dodatnio naładowane peptydy, mogą wchodzić w interakcje z błonami komórkowymi i przenikać przez nieprzepuszczalne dla komórek, ułatwiając dostarczanie ładunków nieprzepuszczalnych dla komórek.
Aby zbadać potencjał przepuszczalności błony testowego CPP in vitro przy użyciu naśladownictwa błony komórkowej, należy rozpocząć od dużego pęcherzyka jednowarstwowego, zawiesiny LUV.
LUV składają się z dwuwarstwy fosfolipidowej wypełnionej nieprzepuszczalną dla błony sondą fluorescencyjną i odpowiednią parą wygaszaczy. W pęcherzykach wygaszacz oddziałuje z sondą fluorescencyjną ze względu na ich bliskie sąsiedztwo, powodując wygaszanie fluorescencji.
Odpipetować zawiesinę LUV do kwarcowej kuwety fluorescencyjnej i rozcieńczyć za pomocą buforu. Dodaj pasek magnetyczny. Przenieść do spektrofluorometru z mieszaniem magnetycznym, aby zapobiec sedymentacji LUV podczas pracy. Określ fluorescencję tła, aby wyeliminować wszelkie wycieki LUV.
W regularnych odstępach czasu dodawaj żądane stężenie CPP do zawiesiny LUV.
Opierając się na hydrofobowości i ładunku reszt aminokwasowych CPP, zaburzają błonę lipidową LUV, prowadząc do penetracji błony i przepuszczalności.
Uszkodzenie błony pęcherzykowej powoduje nieszczelność sondy fluorescencyjnej i wygaszanie do otaczającego roztworu, zwiększając ich przestrzenną separację. W efekcie sonda wykazuje fluorescencję.
Dalsze dodawanie roztworu CPP prowadzi do zwiększonej przepuszczalności LUV i intensywności fluorescencji. Wzrost intensywności fluorescencji z dodatkiem CPP sugeruje potencjał przepuszczalności błony peptydu.
Aby zmierzyć wyciek fluorescencji, rozcieńczyć LUV w 1 mililitrze buforu HEPES 2 w kwarcowej kuwecie fluorescencyjnej do końcowego stężenia 100 mikromoli i dodać mieszadło magnetyczne, aby ułatwić homogenizację roztworu podczas eksperymentu.
Zmierz same LUV w ciągu pierwszych 100 sekund, aby ocenić fluorescencję tła, a następnie zmierz wyciek jako wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu podwielokrotności roztworu peptydu w ciągu następnych 900 sekund.
Aby zmierzyć 100% wyciek fluorescencji jako kontrolę pozytywną, dodaj 1 mikrolitr Triton X-100 do LUV w celu rozpuszczenia pęcherzyków, co spowoduje całkowite odgaśnienie sondy w ciągu ostatnich 100 sekund analizy. Następnie użyj wzoru, aby obliczyć procent wycieku w każdym punkcie czasowym.