JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:09 min • July 8th, 2025
Aby określić ilościowo zawartość rozpuszczalnego białka w tkance roślinnej, w probówce, zacznij od odpowiedniej ilości zmielonej, liofilizowanej tkanki roślinnej.
Dodaj wodorotlenek sodu, zasadę, do probówki i sonicate. Środowisko alkaliczne pod wpływem sił mechanicznych rozrywa pracę komórek, uwalniając zawartość wewnątrzkomórkową, w tym makrocząsteczki - rozpuszczalne białka i węglowodany. Inkubować w wyższych temperaturach.
W obecności ciepła zasady powodują hydrolizę białek, tworząc mniejsze peptydy i zwiększając rozpuszczalność białek. Dodatkowo dochodzi do degradacji węglowodanów.
Odwirować mieszaninę. Zebrać rozpuszczony supernatant zawierający białko. Dodaj kwas solny, aby zneutralizować pH.
Poddać próbkę działaniu kwasu trichlorooctowego, TCA. TCA zaburza powłokę hydratacyjną otaczającą białka, prowadząc do agregacji i wytrącania białek.
Odwirować i usunąć supernatant zawierający TCA. Umyj osad białkowy lodowatym acetonem, aby usunąć wszelkie pozostałości TCA, które mogą zakłócać ocenę rozpuszczalnego białka.
Wysuszyć aceton na powietrzu. Zawiesić osad białkowy w wodorotlenku sodu. Rozcieńczyć wodą dejonizowaną. Przenieś do dołków płytki wielodołkowej.
Dodaj kwaśny roztwór barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250. W warunkach kwaśnych barwnik wiąże się z podstawowymi resztami aminokwasowymi w rozpuszczonych białkach, w wyniku czego powstaje niebieski kompleks białko-barwnik.
Za pomocą spektrofotometru zmierz absorbancję kompleksu białko-barwnik, proporcjonalną do zawartości rozpuszczalnego białka w tkance roślinnej.
Na początek odważ powtórzone próbki każdej tkanki do oznakowanych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. Następnie zapisz dokładną masę każdej próbki. Za pomocą mikropipetora dodać 500 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu do każdej probówki. Zamknij szczelnie pokrywki i sonikuj probówki przez 30 minut.
Następnie umieść rurki w podgrzanej gorącej kąpieli wodnej na 15 minut. Następnie odwirować probówki o masie 15 000 g przez 10 minut. Odpipetować supernatant do nowych, oznakowanych probówek do mikrowirówek, używając nowej końcówki pipety dla każdej próbki.
Dodaj 300 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu do osadu i powtórz wirowanie przez 10 minut. Następnie usunąć supernatant i przenieść go do probówek zawierających supernatant z pierwszego wirowania.
Aby zneutralizować pH supernatantu, dodaj 11 mikrolitrów 5,8-molowego kwasu solnego. Użyj papierka lakmusowego, aby potwierdzić, że pH wynosi około 7.
Następnie dodaj 90 mikrolitrów 100% kwasu trichlorooctowego do każdej probówki. Następnie inkubuj probówki na lodzie przez 30 minut. Odwirować próbki o masie 13 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Ostrożnie użyj przewodu próżniowego i szklanej końcówki do mikropipet, aby usunąć kwas trichlorooctowy.
Bądź bardzo ostrożny, aby nie naruszyć pelletu końcówką ssącą.
Następnie umyj granulat 100 mikrolitrami acetonu schłodzonego do minus 20 stopni Celsjusza. Następnie pozwól acetonowi odparować w dygestorium. Rozpuść osad białkowy w 1 mililitrze wodorotlenku sodu. Mogą być wymagane dodatkowe rundy podgrzewania, wirowania i sonikacji.
Dodać 160 mikrolitrów każdego roztworu wzorcowego IgG do 96-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach, zaczynając od pozycji A1. Następnie w nowej 1,5-mililitrowej probówce dodaj 50 mikrolitrów każdego roztworu próbki do 950 mikrolitrów wody destylowanej. Następnie dodać 60 mikrolitrów każdej rozcieńczonej próbki do płytki studzienkowej w trzech egzemplarzach, zaczynając od pozycji H1. Dodaj 100 mikrolitrów wody destylowanej do wszystkich ślepych i nieznanych studzienek na próbki.
Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 40 mikrolitrów barwnika białkowego Coomassie brilliant blue G-250 do każdego dołka płytki. Za pomocą igły rozbij wszelkie bąbelki znajdujące się w studzienkach. Następnie pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie użyj spektrofotometru do mikropłytek, aby zarejestrować wartości absorbancji dla każdej studzienki przy 595 nanometrach.