Test wzrostu oparty na lucyferazie do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowej reprodukcji pasożytów

Toxoplasma gondii - jednokomórkowy pierwotniak - jest obligatoryjnym pasożytem beztlenowym, rozmnażającym się tylko wewnątrz komórek gospodarza.

Aby określić ilościowo wzrost wewnątrzkomórkowy pasożyta za pomocą testu opartego na lucyferazie, weź zawiesinę komórek pasożyta wyrażających lucyferazy - enzym, który wytwarza luminescencję w reakcji z substratem. Dodaj zawiesinę do hodowli ludzkich fibroblastów napletka i inkubuj przez odpowiedni czas.

Pasożyt wiąże się z receptorami komórek gospodarza i zostaje zinternalizowany w procesie endocytarnym, tworząc parazytoforyczną wakuolę. Struktura zapewnia niszę do rozmnażania się pasożyta.

Po infekcji odessać pożywkę, usuwając niezinternalizowane pasożyty. Dodaj bufor do lizy zawierający detergent i lucyferynę - substrat dla lucyferazy. Detergent w buforze tworzy pory w błonie komórkowej i całkowicie zlizuje komórki, co powoduje uwolnienie lucyferazy.

Uwolniony enzym utlenia cząsteczki lucyferyny, emitując światło. Zmierz intensywność luminescencji, aby określić aktywność lucyferazy. Korzystając z dołków replikujących zawierających zakażone komórki gospodarza, mierz aktywność lucyferazy w określonych odstępach czasu po zakażeniu.

Wykreśl znormalizowaną intensywność luminescencji w przedziałach czasowych, aby uzyskać zmiany fałdowania we wzroście pasożyta w czasie. Czasowy wzrost intensywności wskazuje na udane namnażanie pasożytów.

Wykreśl wartości w skali logarytmicznej, aby obliczyć nachylenie krzywej, reprezentujące czas podwojenia pasożyta.

Aby przeprowadzić test wzrostu Toxoplasmy na bazie lucyferazy, zacznij od ostrożnego odessania pożywki z wstępnie wysianych 96-dołkowych kultur mikropłytek ludzkich fibroblastów napletka i zaszczepij 150 mikrolitrów zawiesiny wolnej od pasożytów do studzienek w formacie trzykolumnowym, pięciorzędowym.

Po czterogodzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych ostrożnie odessać pożywkę z każdej studzienki, aby usunąć niezaatakowane pasożyty, i napełnić studzienki w każdym rzędzie z wyjątkiem pierwszego pożywką o temperaturze pokojowej wolną od czerwieni fenolowej. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 12,5 mikromolowego roztworu substratu lucyferazy w PBS do każdej studzienki górnego rzędu i inkubuj mikropłytki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić pełną lizę komórek.

Pod koniec inkubacji zmierz aktywność lucyferazy na czytniku mikropłytek. Każdy odczyt reprezentuje początkową liczbę zaatakowanych pasożytów w ciągu czterech godzin po zakażeniu. Powtarzaj analizę co 24 godziny przez następne cztery dni bez zmiany pożywki.

Aby obliczyć znormalizowaną zmianę krotności wzrostu pasożyta, każdy odczyt można podzielić przez początkowy odczyt po czterech godzinach od infekcji. Log2 znormalizowanej zmiany krotności wzrostu pasożyta można następnie wykreślić w odniesieniu do każdego punktu czasowego i poddać funkcji regresji liniowej w celu uzyskania nachylenia, które reprezentuje czas podwojenia.