JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:34 min. • July 8th, 2025
Toxoplasma gondii - jednokomórkowy pierwotniak - jest obligatoryjnym pasożytem beztlenowym, rozmnażającym się tylko wewnątrz komórek gospodarza.
Aby określić ilościowo wzrost wewnątrzkomórkowy pasożyta za pomocą testu opartego na lucyferazie, weź zawiesinę komórek pasożyta wyrażających lucyferazy - enzym, który wytwarza luminescencję w reakcji z substratem. Dodaj zawiesinę do hodowli ludzkich fibroblastów napletka i inkubuj przez odpowiedni czas.
Pasożyt wiąże się z receptorami komórek gospodarza i zostaje zinternalizowany w procesie endocytarnym, tworząc parazytoforyczną wakuolę. Struktura zapewnia niszę do rozmnażania się pasożyta.
Po infekcji odessać pożywkę, usuwając niezinternalizowane pasożyty. Dodaj bufor do lizy zawierający detergent i lucyferynę - substrat dla lucyferazy. Detergent w buforze tworzy pory w błonie komórkowej i całkowicie zlizuje komórki, co powoduje uwolnienie lucyferazy.
Uwolniony enzym utlenia cząsteczki lucyferyny, emitując światło. Zmierz intensywność luminescencji, aby określić aktywność lucyferazy. Korzystając z dołków replikujących zawierających zakażone komórki gospodarza, mierz aktywność lucyferazy w określonych odstępach czasu po zakażeniu.
Wykreśl
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych