Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM_2,5 w zarodkach ryb

U danio pręgowanego drobny pył zawieszony w otoczeniu lub PM – zanieczyszczenie powietrza – powoduje nieprawidłowe funkcjonowanie serca wywołane stresem oksydacyjnym.

Aby zbadać wpływ PM na danio pręgowanego, zacznij od wystawienia zarodków danio pręgowanego na pochodzącą z PM, ekstrahowalną materię organiczną, EOM, która wyzwala wytwarzanie reaktywnych form tlenu lub ROS.

ROS utlenia zasadę DNA guaninę do 8-hydroksy-2′-deoksyguanozyny lub 8-OHdG i powoduje fosforylację histonu H2AX w celu utworzenia γH2AX - markera pęknięć podwójnej nici DNA.

Po ekspozycji wytnij serce danio pręgowanego i umieść je na szklanym szkiełku. Traktuj serce roztworem utrwalającym, który sieciuje białka, stabilizując strukturę komórkową.

Następnie dodaj odczynnik blokujący, aby zapobiec niespecyficznym miejscom wiązania. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe, które są skierowane przeciwko γH2AX i 8-OHdG w komórkach serca.

Następnie dodaj dwa różnokolorowe przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie, które specyficznie wiążą się z regionem Fc odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego. Na koniec wybarwić próbkę DAPI - barwnikiem specyficznym dla DNA - który wiąże się z niewielkim rowkiem sekwencji bogatych w AT w DNA, tworząc kompleks fluorescencyjny.

Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby obserwować sygnały z ekspresji 8-OHdG i γH2AX w sercach zarodków danio pręgowanego poddanych działaniu EOM.

Znacznie wysoka intensywność fluorescencji z komórek serca wskazuje na oksydacyjne uszkodzenia DNA wywołane przez EOM i pęknięcia dwuniciowe.

Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystym szkiełku. Dodaj 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu do 1,25 mikrolitra PBS, aby uzyskać roztwór utrwalający. Następnie umieść trzy wypreparowane serca w jednym hydrofobowym kręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut. Umyj szkiełka trzy razy w PBST, przez 5 minut na pranie. Dodaj 50 mikrolitrów BSA do 1,000 mikrolitrów PBST, aby uzyskać 5% roztwór BSA i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.

Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 5 minut na przemycie. Rozcieńczyć dwa mikrolitry mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-hydroksy-deoksyguanozynie i dwa mikrolitry króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko gamma-H2AX w 296 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.

Próbki serca inkubować z 50 mikrolitrami pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał w wilgotnej komorze przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie. Rozcieńczyć 1 mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko myszom znakowanego FITC i 1 mikrolitr koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi cy3 w 500 mikrolitrach PBST, aby uzyskać działający roztwór koktajlu przeciwciał drugorzędowych.

Próbki należy inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.

Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 5 minut na przemycie. Dodaj 20 mikrolitrów DAPI do próbek w celu barwienia jądrowego i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe i uszczelnij je lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się.

Zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Oblicz względne zmiany przy użyciu średniej z prób kontrolnych DMSO i określ istotność statystyczną danych.