$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
W odpowiedzi na ranę komórki wydzielnicze wytwarzają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które aktywują mioblasty – niezróżnicowane komórki mięśniowe. Aktywowane mioblasty migrują w kierunku miejsca rany, gdzie namnażają się, powodując gojenie się rany.
Aby ocenić zdolność migracyjną mioblastów in vitro, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą zlewającą się monowarstwę mysich mioblastów. Za pomocą końcówki pipety zeskrob monowarstwę, aby utworzyć liniową, bezkomórkową plamę wewnątrz studzienki, która symuluje miejsce rany.
Ostrożnie uzupełnij studzienkę podłożem wzrostowym, nie naruszając miejsca na ranę.
Pobrać błoniastą wkładkę zawierającą przylegającą hodowlę komórek grzebienia nerwowego lub NCC - komórek wydzielniczych - w odpowiednim podłożu. Umieść wkładkę w studzience, tak aby NCC u podstawy znajdowały się w pobliżu łaty rany. Inkubuj kokulturę przez pożądany czas.
Podczas inkubacji NCC uwalniają cząsteczki sygnałowe, które wiążą się ze specyficznymi receptorami na mioblastach, inicjując kaskadę sygnałową. Ta sygnalizacja ułatwia reorganizację aktyny w mioblastach, w wyniku czego komórki te rozwijają na swoich krawędziach projekcje cytoplazmatyczne, takie jak lamellipodia i filopodia. Projekcje te pomagają mioblastom migrować w kierunku zranionego obszaru i stopniowo ponownie się zasiedlać, co prowadzi do gojenia się ran.
Umieść płytkę pod mikroskopem i obserwuj gojenie się ran, którego zakres koreluje ze zdolnością migracyjną mioblastów w kokulturze.
Gdy komórki osiągną konfluencję od 70% do 80%, należy usunąć pożywkę supernatantową z komory C2C12 i raz umyć komórki PBS.
Po wyjęciu PBS rozpocznij drapanie komórek, mocno przesuwając sterylną końcówkę pipety P10 w jednym kierunku, aby objąć całą długość lub szerokość monowarstwy komórki. Po zarysowaniu komórek szybko dodaj 1 mililitr PBS.
Następnie włącz komputer i mikroskop. Umieść szkiełko komory na stoliku i obróć tarczę obiektywu do 5-krotnego powiększenia. Otwórz oprogramowanie do obrazowania, kliknij kartę "Kamera", a następnie kliknij przycisk "Na żywo", aby wyświetlić komórki na karcie "AxioCam IC".
Upewnij się, że filtr światła jest całkowicie wysunięty, aby światło mogło przechodzić do aparatu i ekranu komputera. Ręcznie przesuń lub obróć suwak komory, aby ustawić obszar rany na środku obrazu na żywo na karcie "AxioCam IC". Aby zrobić zdjęcia, kliknij "Snap", aby otworzyć zakładkę "Nowy" obok zakładki "AxioCam IC", która zawiera obraz.
Aby zapisać ten nieruchomy obraz, kliknij "Plik", wybierz "Zapisz jako", wybierz "Pulpit" na pasku po lewej stronie, aby zapisać plik na pulpicie. Wprowadź "Nazwa pliku" w polu nazwy pliku i zapisz rysunek w formacie pliku ".czi".
Aby zapisać obraz jako ".tiff", kliknij "Plik", wybierz "Zapisz jako", wprowadź "Nazwa pliku" w polu nazwy pliku, kliknij przycisk "Zapisz jako typ" i wybierz "*.tiff" z menu rozwijanego.
Ręcznie zmień położenie szkiełka komory, aby wykonać dwa lub trzy dodatkowe obrazy w innych punktach rany w tym samym dołku. Po zobrazowaniu usuń PBS z każdej studzienki i dodaj 1 mililitr pożywki C2C12.
Zmontuj system kohodowli studzienka-wkładka, ręcznie umieszczając wkładki zawierające komórki O9-1 w każdym dołku studzienki komory. Delikatnie wepchnij wkładki do studzienki tak, aby spód wkładu znajdował się tuż nad leżącymi poniżej komórkami C2C12. Umieść dobrze włożone konstrukty do inkubatora i pozwól komórkom migrować przez łącznie od 9 do 12 godzin.
Aby określić optymalny czas migracji, należy sprawdzić komórki po sześciu godzinach od powstania rany, a następnie co dwie do trzech godzin. Zakończ eksperyment, gdy komórki w warunkach kontrolnych całkowicie zakryją ranę.