Test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie w celu ilościowego określenia wychwytu aminokwasów przez komórki

Transportery aminokwasów to białka związane z błoną, które pośredniczą w przenoszeniu aminokwasów przez błony komórkowe, regulując ważne procesy komórkowe.

Aby zbadać wychwyt aminokwasów in vitro, należy wziąć hodowlę komórek zrębu pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Odessać pożywkę wzrostową. Dodaj wstępnie podgrzany bufor uzupełniony glutaminą - aminokwasem - znakowanym radioaktywnym wodorem. Inkubować przez wymagany czas.

Wstępnie podgrzany bufor zapewnia fizjologiczną temperaturę i odpowiednie pH wymagane do komórkowego wychwytu glutaminy. Transportery glutaminy składają się z domen transportowych - odpowiedzialnych za translokację substratu poprzez kotransport sprzężony z jonami sodu - oraz domen rusztowania zakotwiczonych w błonie.

Domena transportowa wiąże się ze znakowaną radioaktywnie glutaminą wraz z jonami sodu z buforu. Po związaniu uwalnia cząsteczki do cytoplazmy. Jednocześnie domena transportowa przemieszcza wewnątrzkomórkowe jony sodu i obojętne aminokwasy na zewnątrz komórki, powodując homeostazę komórkową.

Przemyj komórki lodowatym buforem, kończąc reakcję i usuwając wszelkie zewnątrzkomórkowe znakowane radioaktywnie glutaminą. Dodaj roztwór detergentu. Detergent powoduje lizę komórek, powodując uwalnianie wewnątrzkomórkowej glutaminy znakowanej radioaktywnie.

Odwirować lizat. Dodaj supernatant zawierający glutaminę do fiolki z koktajlem scyntylacyjnym i umieść fiolkę w liczniku scyntylacyjnym

.

Znakowane radioaktywnie cząsteczki glutaminy emitują wysokoenergetyczne cząstki beta. Scyntylatory w koktajlu pochłaniają cząsteczki i emitują impulsy świetlne, które są wykrywane przez licznik scyntylacyjny.

Zmierz radioaktywność, aby oszacować wychwyt glutaminy przez komórki.

Aby rozpocząć test wychwytu aminokwasów, umieść 5 x 10⁴ komórek ST2 w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w pożywce alfa-MEM uzupełnionej FBS, penicyliną i streptomycyną. Umieść dodatkowe dołki komórek, aby określić ilościowo liczbę komórek na warunek normalizacji.

Następnie inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa do trzech dni, aż do zlewania się. Po inkubacji odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS o pH 7,4. Następnie odessać PBS przed jednokrotnym umyciem komórek za pomocą jednego mililitra Krebs Ringers HEPES lub KRH.

Inkubować komórki z 0,5 mililitra świeżo przygotowanego KRH zawierającego cztery mikrokiury na mililitr L-[3,4-3 H]-pożywki roboczej Glutaminy przez pięć minut. Po inkubacji zebrać pożywkę radioaktywną w celu dozowania do pojemnika na odpady płynne. Następnie umyj komórki trzykrotnie lodowatym KH, aby zakończyć reakcję.

Następnie dodaj jeden mililitr 1% dodecylosiarczanu sodu do każdej studzienki i rozcieraj mieszaninę 10 razy, aby lizować i homogenizować komórki. Następnie przenieś lizaty komórkowe do 1,5-mililitrowej probówki i sklaruj lizat przez odwirowanie z minimalną prędkością 10 000 g przez 10 minut.

Przenieść supernatant do fiolki scyntylacyjnej, zawierającej osiem mililitrów roztworu scyntylacyjnego i odczytać radioaktywność w liczbach na minutę za pomocą licznika scyntylacyjnego.

Z pozostałych nieradioaktywnych płytek komórek trypsynizować, ponownie zawiesić i policzyć komórki, aby oszacować liczbę komórek w lizowanych kulturach radioaktywnych. Za pomocą hemocytometru policz liczbę komórek w nieradioaktywnym studzience dla każdego warunku doświadczalnego.