JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:08 min. • July 8th, 2025
W żywych komórkach, w warunkach beztlenowych, enzym dehydrogenaza mleczanowa przekształca pirogronian – produkt końcowy glikolizy – w mleczan – kluczowy metabolit. Ilość mleczanu wytwarzanego w komórkach odzwierciedla ich stan metaboliczny.
Aby określić ilościowo wewnątrzkomórkowe stężenie mleczanu, należy rozpocząć od próbki testowej niezawierającego białka lizatu komórkowego nicieni. Uzupełnij inne studzienki płytki wielodołkowej roztworem mleczanu o różnych znanych stężeniach.
W lizacie brakuje wszystkich enzymów białkowych, w tym endogennej dehydrogenazy mleczanowej, co zapewnia dokładną ocenę ilościową mleczanu.
Dodaj bufor do oznaczania mleczanu do każdej studzienki, aby utrzymać odpowiednie pH dla optymalnej aktywności enzymatycznej. Uzupełnij studzienki mieszaniną reakcyjną zawierającą enzym dehydrogenazę mleczanową, dinukleotyd nikotynamido-adeninowy — NAD — koenzym oraz sondę kolorymetryczną i inkubuj.
Podczas inkubacji dehydrogenaza mleczanowa katalizuje utlenianie mleczanu komórkowego do pirogronianu, przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Wygenerowany NADH reaguje z sondą kolorymetryczną, tworząc fioletowy produkt.
Zmierz spektroskopowo absorbancję fioletowego roztwor
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych