Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

0 views • 3:08 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W żywych komórkach, w warunkach beztlenowych, enzym dehydrogenaza mleczanowa przekształca pirogronian – produkt końcowy glikolizy – w mleczan – kluczowy metabolit. Ilość mleczanu wytwarzanego w komórkach odzwierciedla ich stan metaboliczny.

Aby określić ilościowo wewnątrzkomórkowe stężenie mleczanu, należy rozpocząć od próbki testowej niezawierającego białka lizatu komórkowego nicieni. Uzupełnij inne studzienki płytki wielodołkowej roztworem mleczanu o różnych znanych stężeniach.

W lizacie brakuje wszystkich enzymów białkowych, w tym endogennej dehydrogenazy mleczanowej, co zapewnia dokładną ocenę ilościową mleczanu.

Dodaj bufor do oznaczania mleczanu do każdej studzienki, aby utrzymać odpowiednie pH dla optymalnej aktywności enzymatycznej. Uzupełnij studzienki mieszaniną reakcyjną zawierającą enzym dehydrogenazę mleczanową, dinukleotyd nikotynamido-adeninowy — NAD — koenzym oraz sondę kolorymetryczną i inkubuj.

Podczas inkubacji dehydrogenaza mleczanowa katalizuje utlenianie mleczanu komórkowego do pirogronianu, przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Wygenerowany NADH reaguje z sondą kolorymetryczną, tworząc fioletowy produkt.

Zmierz spektroskopowo absorbancję fioletowego roztworu dla badanej próbki i wzorców mleczanu przy 570 nanometrach. Wykreślić wartości absorbancji wzorców mleczanu i wygenerować krzywą kalibracyjną.

Na koniec porównaj wartość absorbancji próbki z wzorcami mleczanu, aby określić ilość mleczanu obecnego w badanej próbce.

Aby zmierzyć stężenie mleczanu, użyj zestawu do testów kolorymetrycznych w celu przeprowadzenia podwójnej analizy dla badanych próbek. Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do każdego dołka 96-dołkowej płytki, a następnie dodaj bufor do oznaczania mleczanu do każdej próbki, aby dostosować objętość do 50 mikrolitrów.

Rozcieńczyć 100-milimolowy wzorzec L(+)-mleczanu buforem do oznaczania mleczanu do 1 milimola. Następnie do szeregu studzienek dodać 0, 2, 4, 6, 8 i 10 mikrolitrów rozcieńczonego wzorca L(+)-mleczanu. Dodaj 50 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 30 minut, aby rozwinął się kolor.

Na koniec użyj czytnika mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 570 nanometrach. Odjąć absorbancję kontrolnej mieszaniny tła od absorbancji mieszaniny reakcyjnej. Następnie wykreśl krzywą wzorcową mleczanu i oblicz stężenia mleczanu na podstawie krzywej, mnożąc każde stężenie przez 2,25.

08:57

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Related Videos

0 Views

06:18

Mapowanie metabolizmu: monitorowanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej bezpośrednio w tkance

Related Videos

0 Views

04:33

Kwantyfikacja masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

Related Videos

0 Views

03:04

Kolorymetryczne wykrywanie biomarkera bakteryjnego za pomocą zmodyfikowanego papierka lakmusowego

Related Videos

0 Views

06:47

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Related Videos

0 Views

04:41

Pomiar aktywności enzymatycznej laktazy w laboratorium dydaktycznym

Related Videos

0 Views

10:05

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Related Videos

0 Views

10:44

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Related Videos

0 Views

09:35

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026