JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 2:29 min • July 8th, 2025
Poziomy komórkowe pirogronianu – kluczowego produktu pośredniego w szlakach biochemicznych wytwarzających energię – można oszacować za pomocą testów kolorymetrycznych opartych na enzymach.
Aby określić poziom pirogronianu w komórkach Caenorhabditis elegans - niepasożytniczego nicienia - weź frakcję komórkową przygotowaną z dorosłych robaków zawierających pirogronian. Roztwór należy poddać obróbce, usuwając białka komórkowe i zebrać oczyszczoną frakcję komórkową — próbkę badaną — zawierającą pirogronian. Brak białek komórkowych zapewnia dokładne określenie poziomu pirogronianu.
Zacznij od dodania odczynnika roboczego zawierającego enzymy oksydazę pirogronianową i peroksydazę chrzanową oraz barwnika chromogennego. Inkubować mieszaninę w ciemności przez odpowiedni czas.
Podczas inkubacji oksydaza pirogronianowa reaguje z pirogronianem - jego substratem - wytwarzając nadtlenek wodoru jako produkt uboczny. Brak światła zapobiega spontanicznemu rozkładowi nadtlenku wodoru.
Peroksydaza chrzanowa katalizuje reakcję między nadtlenkiem wodoru a barwnikiem chromogennym, tworząc kolorowy produkt. Intensywność barwnego produktu reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia pirogronianu w próbce.
Po zakończeniu okresu inkubacji umieścić próbkę w czytniku płytek i zmierzyć absorbancję. Wygeneruj krzywą wzorcową, używając seryjnego rozcieńczania ze znanymi stężeniami pirogronianu.
Wykreślić zmierzoną wartość absorbancji badanej próbki na krzywej w celu określenia stężenia pirogronianu w badanej próbce.
Użyj zestawu do testów kolorymetrycznych, aby zmierzyć stężenie pirogronianu w badanych próbkach i przeprowadzić badania dwustronne.
Dodaj 10 mikrolitrów badanych próbek do różnych dołków 96-dołkowej płytki i dodaj 90 mikrolitrów odczynnika roboczego do każdej próbki. Inkubować pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umieść płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy 570 nanometrach.
Wykreślić krzywą wzorcową pirogronianu i obliczyć stężenia pirogronianu na podstawie krzywej wzorcowej, mnożąc każde stężenie przez 2,25.
Niniejszy artykuł opisuje metodę szacowania wewnątrzkomórkowych poziomów pirogronianu w Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem kolorymetrycznych testów enzymatycznych. Proces obejmuje przygotowanie frakcji komórkowej, poddanie jej obróbce w celu usunięcia białek oraz pomiar absorbancji w celu określenia stężenia pirogronianu.
Ilościowe oznaczanie pirogronianu w frakcjach komórkowych umożliwia precyzyjne profilowanie metaboliczne w preklinicznych systemach modelowych. Ten test kolorymetryczny wspiera zespoły zajmujące się wczesnym odkrywaniem leków, dostarczając wiarygodnych i powtarzalnych danych na temat produktów pośrednich metabolizmu, co pozwala na walidację celów terapeutycznych oraz analizę szlaków metabolicznych. Dokładne ilościowe oznaczenie pirogronianu zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji szlaków metabolicznych w badaniach translacyjnych.
Ten kolorymetryczny test oznaczania pirogronianu integruje się z continuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, wspierając zarówno wczesne testowanie hipotez, jak i późniejszą walidację celów metabolicznych.
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026