Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

Syntaza glikogenu ― kluczowy enzym w syntezie glikogenu ― rozszczepia glukozę difosforanu urydyny lub UDP-glukozę ― cukier nukleotydowy ― na UDP i resztę glikozylu i dodaje uwolniony monomer glukozy do rosnącego łańcucha glikogenu.

Aby oszacować aktywność syntazy glikogenu, zacznij od pobrania mieszaniny reakcyjnej zawierającej glikogen, glukozę UDP, ATP, fosfoenolopirugronian i dinukleotyd nikotynamidoadeninowy lub NADH w probówce. Dodaj difosforan nukleozydu lub NDP, enzym kinazy i koktajl enzymatyczny kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej. Wymieszaj zawartość i inkubuj.

Dodaj próbkę zawierającą syntazę glikogenu do probówki, aby zainicjować reakcję enzymatyczną.

Syntaza glikogenu działa na UDP-glukozę, wytwarzając UDP i resztę glikozylu. Enzym pobiera wolny monomer glukozy i włącza go do łańcucha glikogenu mieszaniny reakcyjnej. W obecności ATP kinaza NDP mieszaniny reakcyjnej fosforyluje niewykorzystany UDP, przekształcając go w UTP i generując ADP.

Enzym kinaza pirogronianowa działa na ADP i dodaje fosforan przekazany przez fosfoenolopirogronian mieszaniny reakcyjnej w celu wytworzenia ATP i pirogronianu. Następnie dehydrogenaza mleczanowa przekształca pirogronian w mleczan i utlenia NADH podczas reakcji.

Zmierz spadek absorbancji NADH przy 340 nm, aby określić ilościowo ilość zużytego NADH, co wskazuje na udaną aktywność enzymu.

Aby rozpocząć od określenia aktywności syntazy glikogenu, należy rozmrozić wcześniej przygotowane roztwory podstawowe UDP-glukozy, ATP, fosfoenolopirogronianu i kinazy NDP na lodzie. Podgrzej łaźnię wodną do 30 stopni Celsjusza.

Gdy roztwory podstawowe są gotowe, należy przygotować wystarczającą ilość mieszaniny do oznaczania zgodnie z liczbą testów syntazy glikogenu, dodając odczynniki do 15-mililitrowej probówki, jak opisano w protokole tekstowym.

Przygotować ślepą próbę, zastępując NADH z mieszaniny reakcyjnej wodą i przenieść reakcję do jednorazowej kuwety z metakrylanu. Użyj ślepej próby, aby ustawić "Zero" na spektrofotometrze na długości fali 340 nanometrów.

Weź jedną podwielokrotność mieszaniny reakcyjnej o pojemności 770 mikrolitrów w 1,5-mililitrowej probówce i kolejno dodaj po 2 mikrolitry do probówki kinazy NDP i mieszaniny kinazy pirogronianowej / dehydrogenazy mleczanowej.

Po delikatnym wymieszaniu inkubować probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 3 minuty, aby wstępnie podgrzać mieszaninę reakcyjną. Następnie dodać 30 mikrolitrów próbki zawierającej syntazę glikogenu do 20-milimolowego buforu Tris o pH 7,8 i delikatnie wymieszać przed przeniesieniem mieszaniny reakcyjnej do jednorazowej kuwety z metakrylanu.

Umieść kuwetę w spektrofotometrze i rejestruj absorbancję przy 340 nanometrach w określonych odstępach czasu przez 10 do 20 minut. Następnie należy wykreślić uzyskane absorbancje w funkcji czasu.