JoVE Encyclopedia of Experiments
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 3:00 min • July 8th, 2025
Podczas zakażenia wirusem grypy wirus dostaje się do komórki przez endocytozę i przejmuje kontrolę nad maszynerią komórki gospodarza, wytwarzając rodowite wiriony. Są one uwalniane, infekując sąsiednie komórki, powodując kaskadę infekcji.
Aby zmierzyć stosunek zakaźnego wirusa grypy do liczby komórek w hodowli - wielość infekcji - dodaj odpowiednią gęstość świeżo uzyskanej zawiesiny komórek ssaków do płytki mikromiareczkowej.
Płytka zawiera złote mikroelektrody mierzące impedancję osadzone w dnie studni. Inkubuj, pozwalając komórkom przylegać do dna studni i osiągnąć fazę wykładniczego wzrostu przed infekcją.
Zastosuj mały potencjał elektryczny między mikroelektrodami. Ogniwa przyklejone do mikroelektrod działają jak izolatory, ograniczając przepływ prądu i zwiększając opór elektryczny - impedancję - która jest mierzona.
Wyjmij nośnik. Odpipetować zawiesinę wirusa grypy do studzienek. Uzupełnij odpowiednią endoproteazę serynową.
Podczas inkubacji endoproteaza serynowa rozszczepia i aktywuje hemaglutyninę glikoproteiny wirusa, ułatwiając jej wiązanie się ze specyficznymi receptorami komórek gospodarza, a następnie wnikanie do komórek wirusa.
Za pomocą maszynerii komórek gospodarza wytwarzane i uwalniane są nowe cząsteczki wirusa, które infekują sąsiednie komórki. W rezultacie komórki zakażone wirusem ulegają zmianom morfologicznym i wykazują działanie cytopatyczne, co prowadzi do śmierci komórki — komórki odrywają się od powierzchni mikroelektrody, zmniejszając impedancję w czasie.
Określ czas potrzebny do zmniejszenia impedancji do połowy impedancji początkowej przed dodaniem wirusa. Krótsze ramy czasowe sugerują większą wielokrotność infekcji wirusowych.
Aby określić korelację między wartościami CIT50 a wielokrotnością infekcji, po wyhodowaniu 3 x 104 świeżo podzielonych komórek MDCK do każdej ściany elektronicznej płytki mikromiareczkowej przez 24 godziny, umyj komórki dwa razy 100 mikrolitrami świeżej pożywki do rozmnażania wirusa na studzienkę na mycie i użyj pipety jednokanałowej, aby dodać 100 mikrolitrów zawiesiny wirusa do każdej studzienki.
Po dodaniu wszystkich rozcieńczeń wirusa, delikatnie załaduj płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 stopni Celsjusza i rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin, jak pokazano.
Po dwóch cyklach pomiarów kliknij, aby "Pauza" urządzenie i wyjmij płytkę E z podstawki. Dodać 100 mikrolitrów pożywki do namnażania wirusa uzupełnionej trypsyną TPCK do każdej studzienki i umieścić płytkę E z powrotem w kieszeni kołyski. Następnie rozpocznij analizę.