Test kinetyki przeżycia oparty na impedancji komórkowej w celu oceny przeżycia wirusa

Wirusy wiążą się z receptorem komórki gospodarza i internalizują się do endosomu. Błona endosomalna łączy się z błoną wirusową, uwalniając zawartość wirusa do wnętrza komórki.

Po dotarciu do jądra genom wirusa ulega transkrypcji na mRNA, a następnie ulega translacji, tworząc białka wirusa. Składniki wirusa dostają się do cytoplazmy i łączą się w wiriony, które wyrywają się z komórki i powodują efekty cytopatyczne ― zmiany w morfologii komórki gospodarza i śmierć.

Aby ocenić kinetykę przeżycia wirusa poprzez pomiar impedancji komórki gospodarza, należy wziąć płytkę wielodołkową pokrytą mikroelektrodami mierzącymi impedancję na jej dnie. Dodaj zawiesinę komórek gospodarza do studzienek i inkubuj, aby komórki przylegały do powierzchni elektrody i rosły.

Następnie weź wstępnie potraktowane zawiesiny wirusowe z solą fizjologiczną o różnych mianach wirusa. Leczenie solą fizjologiczną dostarcza wirusowi chlorek, który wytwarza kwas podchlorawy, który go zabija - zmniejszając zakaźność wirusa. Dodaj te zawiesiny wirusa do odpowiednich studzienek.

Zmierz impedancję komórkową ― zjawisko przeciwstawiania się przepływowi prądu elektrycznego przez elektrody ― przez przylegające ogniwa.

Wirusy infekują przylegające komórki gospodarza i zmieniają ich morfologię, powodując oderwanie się przekształconych komórek od elektrod. Z biegiem czasu, gdy więcej komórek ulega zakażeniu, impedancja komórkowa za pośrednictwem komórki gospodarza zmniejsza się.

Wykreśl indeks komórek, który jest zmianą impedancji spowodowaną oderwaniem zainfekowanej komórki w czasie.

Aby ocenić kinetykę przeżycia wirusa grypy A, dodaj chlorek sodu do końcowego stężenia 35 gramów na litr w wodzie destylowanej i dodaj 900 mikrolitrów powstałego roztworu soli do 2-mililitrowych krioprobówek. Dodaj 100 mikrolitrów wywaru wirusowego do każdej krioprobówki i umieść probówki w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na odpowiedni okres eksperymentalny.

Dzień przed zakończeniem inkubacji wysiać 3 x 10⁴ świeżo rozszczepione komórki MDCK w 100 mikrolitrach pożywki do rozmnażania wirusa na dołek, na 16-dołkowej płytce do mikromiareczkowania i powtórzyć kroki umożliwiające pomiar impedancji tła i równomiernego rozmieszczenia komórek na dnie studzienek. Następnie hoduj komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego dnia umyj komórki dwukrotnie, a następnie zainfekuj je 100 mikrolitrami wirusa destylowanego z soli fizjologicznej, rozcieńczonego 10 razy w świeżej pożywce hodowlanej, jak pokazano, i monitoruj impedancję komórek co 15 minut przez co najmniej 100 godzin.