Test substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym w celu oceny stresu oksydacyjnego w surowicy ludzkiej

Komórki generują niski poziom wolnych rodników podczas procesów metabolicznych.

W stanach patologicznych dochodzi do nadprodukcji wolnych rodników, powodując stres oksydacyjny. Te wolne rodniki atakują wielonienasycone kwasy tłuszczowe w fosfolipidach błony komórkowej w procesie zwanym peroksydacją lipidów. W ten sposób powstają toksyczne produkty utleniania, w tym wodoronadtlenki lipidów i dialdehyd malonowy (MDA), które powodują uszkodzenie błony i śmierć komórki.

Aby wykryć stres oksydacyjny w surowicy ludzkiej in vitro za pomocą testu substancji reagującej z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), należy rozpocząć od probówki zawierającej surowicę ludzką potraktowaną związkiem indukującym utlenianie. Leczona surowica składa się głównie z produktów peroksydacji lipidów - MDA i wodoronadtlenków lipidów - wraz z fosfolipidami, lipidami i białkami.

Następnie dodaj dodecylosiarczan sodu (SDS) i wymieszaj, aby rozpuścić lipidy i uwolnić MDA. SDS denaturuje wszelkie zanieczyszczające białka. Dodać odpowiedni bufor kwasowy, a następnie kwaśny kwas tiobarbiturowy (TBA). Inkubować w wysokiej temperaturze.

W kwaśnych warunkach i wysokich temperaturach cząsteczki TBA reagują z MDA, tworząc stabilny czerwono-różowy kompleks MDA-TBA, zwany TBARS. Inkubować na lodzie, aby zatrzymać reakcję i ustabilizować istniejące kompleksy.

wirówka. Zebrać i przenieść supernatant zawierający MDA-TBA do płytki wielodołkowej. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję kompleksu.

Wyższa absorbancja sugeruje wysokie stężenie TBOS, co wskazuje na wyższy poziom produktów peroksydacji lipidów i stresu oksydacyjnego w surowicy.

Oznacz szklane probówki dla próbek, które mają być analizowane, a następnie dodaj 100 mikrolitrów przygotowanej próbki do każdej probówki. Dodaj 200 mikrolitrów 8,1% SDS do każdej próbki i delikatnie obracaj szklaną rurkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać.

Dodać 1,5 mililitra 3,5-molowego buforu octanu sodu do każdej próbki. Następnie dodaj 1,5 mililitra wodnego 0,8% roztworu kwasu tiobarbiturowego. Doprowadź końcową objętość w każdej probówce do 4 mililitrów, dodając 700 mikrolitrów wody dejonizowanej. Szczelnie zakryj szklane rurki i inkubuj je w bloku grzewczym ustawionym na 95 stopni Celsjusza przez 1 godzinę. Przykryj rurki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji. Następnie wyjmij probówki z bloku i inkubuj je na lodzie przez 30 minut.

Po inkubacji odwirować próbki i wzorce w temperaturze 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Przenieść 150 mikrolitrów supernatantu z każdej probówki do studzienki na 96-dołkowej płytce, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety.

Zmierz absorbancję próbek przy 532 nanometrach. Następnie odejmij średni odczyt absorbancji próbek ślepych od wszystkich innych odczytów absorbancji.

Utwórz krzywą wzorcową i użyj jej do obliczenia nieznanych stężeń próbki.