Test oparty na luminescencji do oceny neurotoksyczności badanych związków na neurony

Wyrost neurytowy – w którym neurony rozwijają projekcje – ma kluczowe znaczenie dla funkcji neuronalnych i regeneracji.

Aby ocenić neurotoksyczne skutki badanych związków sprzyjających wzrostowi neurytów in vitro, należy uzyskać ludzką neuronalną komórkę progenitorową, hNPC, zawiesinę w pożywce różnicowej.

Zasiej komórki w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych poli-L-lizyną i lamininą, ułatwiając przyczepianie komórek do dna studzienki i wspierając wzrost komórek. Składniki pożywki różnicującej sprzyjają różnicowaniu hNPC w neurony.

Potraktuj jeden zestaw studzienek związkiem testowym promującym wzrost neurytów. Oddziałuje to z neuronami pochodzącymi z hNPC i może indukować wzrost neurytów, bez zakłócania komórkowych procesów metabolicznych i późniejszego stężenia trifosforanu adenozyny, ATP - podstawowego źródła energii komórkowej.

Dodaj jednoetapowy odczynnik zawierający detergenty, enzym lucyferazy i substrat lucyferazy, lucyferynę i inhibitory ATPazy wraz z jonami magnezu i wymieszaj.

Detergenty rozrywają błonę komórkową, powodując lizę komórek i wewnątrzkomórkowe uwalnianie ATP do roztworu. Inhibitory ATPazy hamują uwalnianą endogenną ATPazę, która może zakłócać pomiar ATP. Wirówka, osadzanie szczątków komórkowych.

Podczas inkubacji uwolnione ATP z jonami magnezu powodują wiązanie lucyferyny z lucyferyną, co powoduje utlenianie lucyferyny do wysoce wzbudzonej oksylucyferyny, emitując bioluminescencyjny foton po relaksacji do stanu podstawowego. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz luminescencję, wskazującą stężenie ATP.

Wyższe stężenie ATP oznacza wyższą żywotność komórek, co sugeruje brak znaczącej toksyczności badanego związku na neurony.

Aby pokryć płytkę, dodaj 30 mikrolitrów poli-L-lizyny do każdego dołka płytki 384-dołkowej i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Umyj go dwukrotnie PBS i pozostaw do wyschnięcia na około 30 minut.

Dodaj 30 mikrolitrów lamininy do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 godziny. Powtórz płukanie za pomocą PBS i przystąp do powlekania komórek. Dodaj 20 000 neurosfer jednokomórkowych w 25 mikrolitrach pożywki różnicującej do każdego dołka płytki 384-dołkowej i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 dni.

Umiejętności pipetowania o wysokiej precyzji są wymagane do posiewu dokładnej liczby neurosfer, które są rozdzielane na pojedyncze komórki. Dlatego zaleca się różnicowanie neurosfer w neurony przed posiewem, aby osiągnąć bardziej powtarzalne wyniki.

Po inkubacji dodać 5 mikrolitrów badanego związku do każdej studzienki o 6-krotnym pożądanym stężeniu i inkubować komórki przez kolejne 24 godziny.

Aby wykonać test żywotności komórek, dodaj 30 mikrolitrów odczynnika luminescencyjnego do każdej studzienki i pozostaw płytkę na wytrząsarce na 2 minuty. Odwirować płytkę w temperaturze od 300 do 400 razy g przez 30 sekund. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, chroniąc ją przed światłem. Po inkubacji zmierz luminescencję na czytniku mikropłytek.