Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 4:02 min. • July 8th, 2025
Interakcje białko-białko mają kluczowe znaczenie dla ważnych funkcji komórkowych.
Aby zbadać interakcje między białkami transbłonowymi - białkami błonowymi, które obejmują dwuwarstwę lipidową błony komórkowej, należy rozpocząć od studzienek płytki wielodołkowej zawierającej przylegającą hodowlę komórek ssaków.
Następnie dodać roztwór zawierający odpowiedni środek do transfekcji i parę plazmidów ekspresyjnych.
Jeden z plazmidów ekspresyjnych koduje białko transbłonowe będące przedmiotem zainteresowania połączone z małym niefunkcjonalnym fragmentem enzymu lucyferazy; drugi plazmid koduje drugie białko transbłonowe będące przedmiotem zainteresowania, połączone z dużym niefunkcjonalnym fragmentem enzymu lucyferazy.
Inkubuj płytkę. Środek transfekcyjny ułatwia wychwyt komórkowy plazmidów ekspresyjnych.
Pomyślnie transfekowane komórki wykazują ekspresję białek transbłonowych. Interakcja między wyrażonymi białkami transbłonowymi zbliża małe i duże fragmenty skierowane w stronę cytoplazmy, powodując ich wiązanie i tworzenie aktywnego enzymu lucyferazy.
Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką niezawierającą surowicy, aby zminimalizować luminescencję tła. Dodaj furimazynę — przepuszczalny dla
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych