Test dzielonej komplementacji lucyferazy w celu identyfikacji specyficznych interakcji białko-białko

Interakcje białko-białko mają kluczowe znaczenie dla ważnych funkcji komórkowych.

Aby zbadać interakcje między białkami transbłonowymi - białkami błonowymi, które obejmują dwuwarstwę lipidową błony komórkowej, należy rozpocząć od studzienek płytki wielodołkowej zawierającej przylegającą hodowlę komórek ssaków.

Następnie dodać roztwór zawierający odpowiedni środek do transfekcji i parę plazmidów ekspresyjnych.

Jeden z plazmidów ekspresyjnych koduje białko transbłonowe będące przedmiotem zainteresowania połączone z małym niefunkcjonalnym fragmentem enzymu lucyferazy; drugi plazmid koduje drugie białko transbłonowe będące przedmiotem zainteresowania, połączone z dużym niefunkcjonalnym fragmentem enzymu lucyferazy.

Inkubuj płytkę. Środek transfekcyjny ułatwia wychwyt komórkowy plazmidów ekspresyjnych.

Pomyślnie transfekowane komórki wykazują ekspresję białek transbłonowych. Interakcja między wyrażonymi białkami transbłonowymi zbliża małe i duże fragmenty skierowane w stronę cytoplazmy, powodując ich wiązanie i tworzenie aktywnego enzymu lucyferazy.

Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką niezawierającą surowicy, aby zminimalizować luminescencję tła. Dodaj furimazynę — przepuszczalny dla komórek substrat lucyferazy — roztwór. Furimazyna dostaje się do komórek, po czym lucyferazy utlenia furimazynę, generując luminescencję o wysokiej intensywności.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz luminescencję, która sugeruje silne oddziaływanie między białkami transbłonowymi.

Zbierz przylegający HEK293T hodowli komórkowej przez trypsynizację i ponownie zawieś komórki w dedykowanym kompletnym pożywce wzrostowej. Umieść komórki na przezroczystej, białej, 96-dołkowej płytce po białej stronie. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby. Następnie hoduj komórki przez noc w standardowych warunkach.

Następnego dnia należy przetransfekować komórki pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych. Rozcieńczyć plazmidy w podłożu bez surowicy do 6,25 nanogramów na mikrolitr dla każdego konstruktu i dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów w odpowiednim stosunku lipidów do DNA.

Inkubuj plazmidy zgodnie z instrukcją producenta. Następnie dodaj 8 mikrolitrów mieszaniny lipid-DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość płytki z delikatnym obracaniem i hoduj komórki przez 20 do 24 godzin w standardowych warunkach.

Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę w każdej studzience 100 mikrolitrami pożywki bez surowicy, upewniając się, że komórki nie odczepiają się po wymianie pożywki.

Tuż przed pomiarem luminescencji należy zmieszać jedną objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego. Dodaj 25 mikrolitrów roztworu roboczego furimazyny do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej.

Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych i równoważ płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut. Wybierz studzienki do analizy i odczytaj luminescencję z czasem integracji wynoszącym 0,3 sekundy. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie dwie godziny.