Test immunoprecypitacyjny do badania interakcji receptorów enzymatycznych w transfekowanych komórkach

Programowana śmierć-1, PD-1, białko receptora powierzchniowego komórki, zawiera dwa cytoplazmatyczne motywy tyrozynowe - motyw hamujący (ITIM) i motyw przełącznika (ITSM). Wiązanie liganda indukuje fosforylację ITIM i ITSM oraz rekrutację białka fosfatazy tyrozynowej SHP2 do domeny cytoplazmatycznej PD-1, wyzwalając kaskadę sygnalizacyjną w dół.

Aby zbadać interakcje SHP2-PD-1 za pomocą testu koimmunoprecypitacji, należy uzyskać przylegającą hodowlę komórek nabłonkowych. Komórki te wyrażają zielone białko fluorescencyjne, PD-1 typu dzikiego znakowane GFP z fosforylowanymi ITIM i ITSM. Uzyskaj komórki nabłonkowe eksprymujące zmutowany PD-1 znakowany GFP, w którym mutacje ITIM lub ITSM hamują ich fosforylację.

Dodać bufor do lizy zawierający detergent i ortowanadan sodu. Detergenty powodują lizę komórek, powodując uwalnianie białka PD-1 znakowanego GFP. Ortowanadan sodu blokuje uwalnianie fosfataz, zapobiegając w ten sposób defosforylacji ITIM i ITSM.

Odwirować lizat. Przenieść supernatant zawierający białko do świeżych probówek. Dodaj kulki agarozy pokryte przeciwciałem anty-GFP. Białka PD-1 znakowane GFP wiążą się z przeciwciałami anty-GFP.

Inkubować z zawiesiną SHP2. Związany z kulkami PD-1-GFP wiąże SHP2 poprzez fosforylowane ITIM i ITSM.

Dodać bufor Laemmli i zagotować, aby środki redukujące i detergenty w buforze zdenaturowały kompleksy białkowe PD-1-GFP-SHP2. Odwirować i zebrać supernatant zawierający zdenaturowane kompleksy białkowe. Wykonaj SDS-PAGE i western blot.

PD-1 typu dzikiego i zmutowanego ITIM oddziałuje z SHP2. Mutanty ITSM nie wiążą SHP2, co wskazuje, że interakcja PD1-SHP2 wymaga fosforylowanego ITSM.

Podczas wykonywania immunoprecypitacji wszystkie kroki powinny być wykonywane albo na lodzie, albo w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Uzupełnij bufor do lizy inhibitorami proteazy, rozpuszczając jedną tabletkę inhibitorów w 10 mililitrach buforu. Należy również dodać 1 milimol ortowanaradanu sodu do buforu, który będzie używany na płytkach transfekowanych PD1-GFP. Dodaj 500 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy do komórek, upewniając się, że dodałeś bufor do lizy zawierający ortowananan sodu tylko do płytek zawierających transfekowane komórki PD1-GFP.

Użyj skrobaka do komórek, aby natychmiast usunąć i zebrać komórki z płytek. Przełóż lizaty do 1,5-mililitrowych zimnych probówek i obracaj je 0,005 razy g i w 4 stopniach Celsjusza przez 30 minut. Aby zebrać supernatant post-jądrowy z lizatów, wiruj je w dół z prędkością 10 000 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez 10 minut.

Przenieść supernatanty do nowych probówek i wyrzucić osad. Przechowywać supernatanty w drugim zestawie sześciu płytek na lodzie, do późniejszej analizy WCL.

Aby rozpocząć przygotowywanie kulek anty-GFP, delikatnie potrząśnij butelką zawierającą kulki przed otwarciem, aby zapobiec osiadaniu. Usuń 40 mikrolitrów kulek anty-GFP z gnojowicy na każdy warunek. Wirować w temperaturze 500 razy g i 4 stopnie Celsjusza przez 3 minuty. Usuń supernatant, aby umyć kulki, upewniając się, że minimalizujesz kontakt pipety z kulkami, aby zapobiec utracie.

Ponownie zawiesić kulki w 80 mikrolitrach buforu do lizy na próbkę. Dodać umyte kulki bezpośrednio do lizatu komórkowego z komórek wykazujących ekspresję PD1-GFP z pierwszego zestawu czterech płytek. Obracaj z prędkością 0,005 razy g przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby immunoprecypitować białka znakowane GFP. Umyj kulki trzy razy za pomocą 1 mililitra zimnego buforu do lizy, który nie zawiera ortowanadatu do każdego prania. Następnie odwirować pod ciśnieniem 2500 razy g przez 10 sekund.

Podzielić lizat aktywnego SHP2 z pierwszego zestawu płytek na trzy równe porcje i dodać porcję do każdej z trzech probówek zawierających przemyte kulki zawierające PD1-GFP. Dodać 1/3 objętości lizatu z komórek nietransfekowanych do drugiej probówki kulek PD1-GFP typu dzikiego. Wyrzuć pozostałe 2/3 rds.

Inkubuj kulki przez 4 godziny w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym obrotem 0,005 razy g. Następnie umyj kulki dwukrotnie, używając 1 mililitra zimnego buforu do lizy na każde pranie. Dodaj 80 mikrolitrów buforu do lizy do każdej próbki, upewniając się, że całkowita objętość w każdej probówce wynosi 100 mikrolitrów. Za pomocą odciętej końcówki pipety delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby wymieszać. Następnie przenieś 50 mikrolitrów z każdej probówki do dwóch świeżych probówek o pojemności 1,5 mililitra.

Najpierw odwiruj kulki w temperaturze 2000 g i 4 stopnie Celsjusza przez 30 sekund i usuń supernatant. Dodaj 20 mikrolitrów 2x buforu Laemmli i gotuj w 95 stopniach Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą zestawu BCA zmierz stężenie białka w kontrolkach wejściowych.

Przenieś 30 mikrolitrów najbardziej rozcieńczonej próbki do nowej probówki. Użyć buforu do lizy, aby rozcieńczyć resztę wejściowych kontroli do tego samego stężenia, co najbardziej rozcieńczona próbka. Następnie przenieś 30 mikrolitrów każdej z rozcieńczonych kontrolek wejściowych do nowej probówki. Dodaj równe objętości 2x buforu Laemmli do lizatów i gotuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie odwiruj kulki z prędkością 2,000 g i 4 stopni Celsjusza przez 30 sekund przed wykonaniem analizy Western blot, jak opisano w protokole tekstowym.