Test immunoprecypitacyjny do badania interakcji receptorów enzymatycznych w transfekowanych komórkach
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 7:13 min. • July 8th, 2025
Programowana śmierć-1, PD-1, białko receptora powierzchniowego komórki, zawiera dwa cytoplazmatyczne motywy tyrozynowe - motyw hamujący (ITIM) i motyw przełącznika (ITSM). Wiązanie liganda indukuje fosforylację ITIM i ITSM oraz rekrutację białka fosfatazy tyrozynowej SHP2 do domeny cytoplazmatycznej PD-1, wyzwalając kaskadę sygnalizacyjną w dół.
Aby zbadać interakcje SHP2-PD-1 za pomocą testu koimmunoprecypitacji, należy uzyskać przylegającą hodowlę komórek nabłonkowych. Komórki te wyrażają zielone białko fluorescencyjne, PD-1 typu dzikiego znakowane GFP z fosforylowanymi ITIM i ITSM. Uzyskaj komórki nabłonkowe eksprymujące zmutowany PD-1 znakowany GFP, w którym mutacje ITIM lub ITSM hamują ich fosforylację.
Dodać bufor do lizy zawierający detergent i ortowanadan sodu. Detergenty powodują lizę komórek, powodując uwalnianie białka PD-1 znakowanego GFP. Ortowanadan sodu blokuje uwalnianie fosfataz, zapobiegając w ten sposób defosforylacji ITIM i ITSM.
Odwirować lizat. Przenieść supernatant zawierający białko do świeżych probówek. Dodaj kulki agarozy pokryte przeciwciałem anty-GFP. Białka PD-1 znakowane GFP wiążą się z przeciwciałami anty-GFP.
Inkubować z zawiesiną SHP2. Związany z ku
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych