Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji może określić stan oligomeryzacji białek w próbce.

Na początek weź szkiełko z komorą zawierającą znakowany fluorescencyjnie roztwór monomeru białkowego. Umieść szkiełko pod mikroskopem konfokalnym. Skoncentruj wiązkę laserową na niewielkiej części próbki - objętości konfokalnej - aby wzbudzić monomery białkowe.

Cząsteczki białka dyfundują do i z objętości konfokalnej z powodu ruchów Browna. Ruch ten powoduje gwałtowne zmiany intensywności fluorescencji, co prowadzi do wahań intensywności fluorescencji w czasie.

Dodaj środek dimeryzujący - dwuwartościowy ligand, który pomaga dwóm monomerom białkowym związać się, a tym samym utworzyć dimer. Ze względu na dimeryzację dwie etykiety fluorescencyjne łączą się, tworząc pojedynczą cząstkę, co zwiększa intensywność fluorescencji na cząstkę - jasność molekularną.

Wzrost jasności molekularnej spowodowany dimeryzacją zwiększa amplitudę fluktuacji fluorescencji - gdy dwie fluorescencyjne etykiety wchodzą i opuszczają objętość konfokalną razem.

Uzyskaj obrazy objętości konfokalnej w czasie przed i po dodaniu środka dimeryzującego.

Oblicz jasność poszczególnych pikseli na obrazach konfokalnych i uzyskaj średnią krzywą jasności w czasie.

Dodanie środka dimeryzującego powoduje dwukrotny wzrost jasności dzięki podwójnym sygnałom fluorescencyjnym z każdej cząstki, podczas gdy całkowita liczba cząsteczek białka pozostaje taka sama - co wskazuje na tworzenie dimerów.

Aby skonfigurować wielodołkową matrycę płytkową, najpierw przygotuj roztwór 100 nanomolowych oczyszczonych FKBP12 w tym samym buforze, który jest używany do chromatografii wykluczania wielkości. Sonikacja i wirowanie z szybkim wirowaniem 13 000 obr./min, aby zapobiec tworzeniu się agregatów.

Teraz odpipetuj od 100 do 200 mikrolitrów rozcieńczonego białka do 8-dołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem. Dodaj dimeryzator BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nanomolowych. Jako odniesienie przygotuj roztwór 100 nanomolowych mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i wytrącania oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.

Można zastosować dowolny system konfokalny mikroskopu skaningowego światła wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe i zdolny do utrzymania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela. Wybierz obiektyw zanurzeniowy z korekcją kołnierza przeznaczony do spektroskopii korelacji fluorescencji.

Teraz dodaj kroplę wody do celu korekcyjnego zanurzenia w wodzie kołnierza. Zamontuj 8-dołkową komorę obserwacyjną w scenie. Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia, włączając laser 514 nm i ustawiając go na moc od 20 do 100 nanowatów na wyjściu z obiektywu. Włącz jeden detektor HyD. Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów. Wybierz okno emisji od 520 do 560 nanometrów.

W trybie akwizycji użyj 16 na 16 pikseli.

Ustaw czas przebywania pikseli tak, aby czas przebywania pikseli był dłuższy niż dyfuzja białek, a czas przebywania pikseli był znacznie krótszy. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na około 13 mikrosekund dla systemu użytego w tej demonstracji.

Ustaw otwór w jednej jednostce Airy, aby uzyskać odpowiednią emisję około 545 nanometrów. Wybierz tryb akwizycji xy-time i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pozyskane na akwizycję i dobrze. Teraz ustaw rozmiar piksela na około 120 nanometrów.

Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu oraz liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces. Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5,000. klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania 10,000 obrazów.

Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu. Następnie rozpocznij akwizycję i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.