Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji może określić stan oligomeryzacji białek w próbce.

Na początek weź szkiełko z komorą zawierającą znakowany fluorescencyjnie roztwór monomeru białkowego. Umieść szkiełko pod mikroskopem konfokalnym. Skoncentruj wiązkę laserową na niewielkiej części próbki - objętości konfokalnej - aby wzbudzić monomery białkowe.

Cząsteczki białka dyfundują do i z objętości konfokalnej z powodu ruchów Browna. Ruch ten powoduje gwałtowne zmiany intensywności fluorescencji, co prowadzi do wahań intensywności fluorescencji w czasie.

Dodaj środek dimeryzujący - dwuwartościowy ligand, który pomaga dwóm monomerom białkowym związać się, a tym samym utworzyć dimer. Ze względu na dimeryzację dwie etykiety fluorescencyjne łączą się, tworząc pojedynczą cząstkę, co zwiększa intensywność fluorescencji na cząstkę - jasność molekularną.

Wzrost jasności molekularnej spowodowany dimeryzacją zwiększa amplitudę fluktuacji fluorescencji - gdy dwie fluorescencyjne etykiety wchodzą i opuszczają objętość konfokalną razem.

Uzyskaj obrazy objętości konfokalnej w czasie przed i po dodaniu środka dimeryzującego.

Oblicz jasność poszczególnych pikseli na obrazach konfokalnych i uzyskaj śred