Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

W swojej aktywnej postaci monomer Ras związany z błoną plazmatyczną ― białko wiążące nukleotydy guaniny ― rekrutuje Raf, nieaktywną kinazę białkową, która wiąże się z Ras poprzez domenę wiążącą Ras.

To wiązanie powoduje powstanie funkcjonalnego kompleksu Ras-Raf, który wyzwala dalszy proces sygnalizacji.

Aby zobrazować wewnątrzkomórkową interakcję Ras-Raf, zacznij od zawieszenia genetycznie zmodyfikowanych komórek w dobrze wyposażonym szkiełku. Komórki te wyrażają dwa niefluorescencyjne białka fuzyjne - jedno składa się z Ras połączonego z jedną połową fotoaktywowanego fluoroforu za pośrednictwem jego N-końca, a drugie to Raf połączony z drugą połową tego samego fluoroforu na jego C-końcu.

Wewnątrz komórek białka fuzyjne zawierające Ras dokują się do błony plazmatycznej i oddziałują z białkami fuzyjnymi zawierającymi Raf, odtwarzając fragmenty białka fluorescencyjnego w kompletny fotoaktywowany fluorofor. Brak wiązania Ras i Raf utrzymuje dwie połówki fluoroforu oddzielone.

Dodać odczynnik utrwalający do szkiełka. Cząsteczki utrwalające tworzą wiązania krzyżowe z białkami i stabilizują kompleksy białkowe.

Usunąć odczynnik utrwalający i dodać bufor do obrazowania. Umieść szkiełko po