Anizotropia fluorescencyjna w celu określenia powinowactwa wiązania czynnika transkrypcyjnego i DNA

Czynnik transkrypcyjny, TF, jest białkiem, które wiąże się ze specyficznym regionem DNA genu i reguluje transkrypcję.

Aby zmierzyć interakcje TF-DNA za pomocą anizotropii fluorescencji, weź płytkę wielodołkową. Dodać stopiony żel zmieszany z buforowym roztworem, zawierającym znane stężenia referencyjnego DNA znakowanego fluoroforem, składającego się z miejsca wiązania TF i wyższego stężenia cząsteczek TF, do dołka i inkubować.

Gdy znakowane referencyjne DNA rozprowadza się w żelu, wyższe stężenie cząsteczki TF zapewnia, że wszystkie cząsteczki DNA są związane z TF. Dodać buforowany roztwór zawierający nieznakowane DNA konkurenta z mutacją jednopunktową.

Przeanalizuj żel płytki za pomocą wysokowydajnej mikroskopii anizotropii fluorescencyjnej.

Światło spolaryzowane wzbudza referencyjny fluorofor związany z DNA, który zmienia orientację w wyniku wirowania molekularnego i emituje wielokierunkowe zdepolaryzowane światło ― zjawisko zwane anizotropią fluorescencji, FA.

Po związaniu się z TF, masa cząsteczkowa referencyjnego fluoroforu związanego z DNA wzrasta i opada wolniej, emitując więcej spolaryzowanego światła, które zwiększa FA.

Nieznakowane DNA konkurenta dyfunduje z czasem po mat