Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Systematyczna ewolucja ligandów poprzez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) umożliwia identyfikację sekwencji RNA wiążących białka.

Po pierwsze, uzyskaj losową pulę RNA zawierającą znakowane radioaktywnie RNA z randomizowanymi sekwencjami, które składają się w wysoce specyficzne struktury. Inkubować z białkiem docelowym. Białko wiąże się z cząsteczkami RNA o określonych sekwencjach i trójwymiarowych strukturach, podczas gdy niespecyficzne RNA pozostają niezwiązane.

Przepuść mieszaninę przez filtr nitrocelulozowy. Niezwiązane RNA przechodzi przez pory filtracyjne, podczas gdy kompleksy RNA-białko pozostają zachowane.

Posiekaj filtr zawierający kompleks RNA-białko na fragmenty. Powtórz interakcję RNA-białko poprzez inkubację puli RNA ze zmniejszonym stężeniem białka docelowego - umożliwiając tylko wiązanie sekwencji o wysokim powinowactwie, podczas gdy sekwencje o niskim powinowactwie nie wiążą się.

Załaduj tę mieszaninę na żel poliakrylamidowy i wykonaj elektroforezę. Kompleksy RNA-białko migrują powoli przez żel w porównaniu z niezwiązanymi RNA o niskim powinowactwie. Obrazowanie rentgenowskie żelu pokazuje przesunięcie pasma odpowiadające lokalizacji kompleksu RNA-białko

.

Pokrój porcj