Test wiązania in vitro oparty na SELEX w celu identyfikacji interakcji RNA-białko

Systematyczna ewolucja ligandów poprzez wzbogacanie wykładnicze (SELEX) umożliwia identyfikację sekwencji RNA wiążących białka.

Po pierwsze, uzyskaj losową pulę RNA zawierającą znakowane radioaktywnie RNA z randomizowanymi sekwencjami, które składają się w wysoce specyficzne struktury. Inkubować z białkiem docelowym. Białko wiąże się z cząsteczkami RNA o określonych sekwencjach i trójwymiarowych strukturach, podczas gdy niespecyficzne RNA pozostają niezwiązane.

Przepuść mieszaninę przez filtr nitrocelulozowy. Niezwiązane RNA przechodzi przez pory filtracyjne, podczas gdy kompleksy RNA-białko pozostają zachowane.

Posiekaj filtr zawierający kompleks RNA-białko na fragmenty. Powtórz interakcję RNA-białko poprzez inkubację puli RNA ze zmniejszonym stężeniem białka docelowego - umożliwiając tylko wiązanie sekwencji o wysokim powinowactwie, podczas gdy sekwencje o niskim powinowactwie nie wiążą się.

Załaduj tę mieszaninę na żel poliakrylamidowy i wykonaj elektroforezę. Kompleksy RNA-białko migrują powoli przez żel w porównaniu z niezwiązanymi RNA o niskim powinowactwie. Obrazowanie rentgenowskie żelu pokazuje przesunięcie pasma odpowiadające lokalizacji kompleksu RNA-białko

Pokrój porcję żelu zawierającą kompleks. Dodaj proteinazę K do fragmentów filtra i plastrów żelu, trawiąc białka i uwalniając RNA z kompleksu. Dodać fenol-chloroform i odwirować, oddzielając RNA od strawionych białek.

Zmieszać supernatant zawierający RNA z octanem sodu i etanolem. Odwirować w celu wytrącenia RNA. Zawiesić w wodzie wolnej od RNaz. Odwrotna transkrypcja RNA do komplementarnego DNA i amplifikacja DNA metodą PCR.

Powtórz kilka rund separacji opartej na filtrze i żelu, aby uzyskać pulę sekwencji DNA specyficznych dla docelowego białka.

Aby związać białko i RNA w objętości reakcyjnej 100 mikrolitrów, najpierw przygotuj 10 milimolowy trischlorowodorek o pH 7,5, zawierający 50 milimolowy chlorek potasu, jeden milimolowy DTT, 0,09 mikrograma na mikrolitr albuminy surowicy bydlęcej, 0,5 jednostki na mikrolitr RNAsin, 0,15 mikrograma na mikrolitr tRNA i 1 milimolowy EDTA. Następnie dodaj 30 mikrolitrów rekombinowanego białka PTB i 10 mikrolitrów RNA z odpowiedniej puli.

Umieść probówki zawierające reakcje wiązania w bloku temperaturowym na około 30 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA przez cztery rundy selekcji i amplifikacji. Najpierw przefiltruj próbkę o pojemności 100 mikrolitrów w temperaturze pokojowej przez filtr nitrocelulozowy przymocowany do kolektora próżniowego. Kompleks RNA-białko pozostaje na filtrze.

Za pomocą sterylnej żyletki posiekaj filtr na fragmenty i włóż je do probówki wirówkowej. Zanurz fragmenty filtra w buforze proteinazy K i umieść je na bębnie na co najmniej trzy godziny lub na noc, aby odzyskać RNA.

Aby odbiałościć próbkę RNA, dodaj równą objętość fenolu-chloroformu, wir. A następnie wirować z dużą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Uzyskać fazę wodną i ponownie ekstrahować chloroformem. Następnie wymieszać supernatant z 1/10 objętości 3-molowego octanu sodu o pH 5,2 i dwiema do trzech objętości absolutnego alkoholu etylowego.

Pozostaw probówkę w zamrażarce o temperaturze -80 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie odwiruj ją na wysokich obrotach przez 10 minut. Powtórz etapy mycia i suszenia z 70% etanolem i rozpuścij RNA w wodzie uzdatnionej DEPC. Po pierwszej rundzie testu wiązania filtra przeprowadź trzy kolejne rundy.

Następnie wykonaj dwie rundy transkrypcji, wiązania i amplifikacji, aby oddzielić frakcje RNA związane z białkiem od frakcji niezwiązanych. Wstępnie wylej natywny 5% żel poliakryloamidowy o stosunku bisakryloamidu 60 do 1 w buforze 0,5x TBE. Następnie ustaw reakcję wiązania RNA-białko.

Umieść żel w urządzeniu do elektroforezy wypełnionym 0,5x buforem TBE w chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zastosuj napięcie 250 V przez 15 minut i pipetuj reakcję wiązania do różnych studzienek. Następnie, dalej, frakcjonuj związany RNA od niezwiązanego RNA, uruchamiając elektroforezę przy napięciu 250 woltów przez jedną do dwóch godzin.

Następnie należy naświetlić żel folią rentgenowską i określić położenie związanego RNA za pomocą autoradiografii. Wytnij plasterek żelu ze związanym RNA i włóż go do probówki. Rozdrobnić plasterek żelu i inkubować w buforze proteinazy K przez trzy godziny lub przez noc. Powtórzyć ekstrakcję za pomocą chloroformu fenolowego i chloroformu, jak opisano wcześniej. Zsyntetyzuj cDNA z rozpuszczonego RNA.

Przygotuj 20 mikrolitrów reakcji, w tym dwa mikrolitry buforu 10x RT, dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy AMV, 1 mikrolitr odwróconego startera, 5 mikrolitrów wody i 10 mikrolitrów rozpuszczonego RNA. Inkubować w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Amplifikuj cDNA za pomocą 20 do 25 cykli PCR, jak opisano wcześniej. Powtórz proces syntezy RNA, wiązania białek i oddzielania frakcji związanych z białkiem i niezwiązanych.