Różnicowa kalorymetria skaningowa do badania interakcji DNA aptamer-termolabilny ligand

Różnicowa kalorymetria skaningowa pomaga badać interakcje biomolekuła-ligand poprzez pomiar ciepła wymaganego do denaturacji biomolekuły przy braku i obecności liganda.

Na początek weź odniesienie zawierające wolne aptamery DNA - strukturalne jednoniciowe oligonukleotydy - oraz próbkę zawierającą termolabilne aptamery związane z ligandem. Ligandy stabilizują drugorzędową strukturę aptameru.

Wykonaj skanowanie do przodu, podgrzewając roztwory. Po osiągnięciu temperatury topnienia wolne aptamery ulegają denaturacji.

Stabilizowane ligandem aptamery dysocjują od ligandów i ulegają denaturacji w stosunkowo wyższej temperaturze, powodując wzrost temperatury topnienia w porównaniu z wolnymi aptamerami. W wysokich temperaturach podzbiór ligandów uzyskuje nieodwracalną formę drugorzędową o niskim powinowactwie wiązania.

Następnie należy wykonać skanowanie wsteczne poprzez schłodzenie roztworów w celu odzyskania struktury aptameru. W niższej temperaturze początkowe i przekształcone ligandy w próbce wiążą się z aptamerami.

Podczas drugiego skanowania do przodu aptamery związane ze słabym powinowactwem do przekształconych ligandów dysocjują i ulegają denaturacji w niższej temperaturze niż początkowe aptamery związane z ligandami, powodując spadek temperatury topnienia.

Przy kolejnych skanach ligandy kontynuują przekształcanie się w formę wtórną, co powoduje całkowite zubożenie formy początkowej. Uzyskaj termogram.

Z każdym skanowaniem temperatura topnienia aptameru związanego z ligandem przesuwa się w kierunku wolnego aptameru, co wskazuje na słabe powinowactwo wiązania formy wtórnej.

Odgazowanie roztworów buforu, biomolekuły i liganda w odgazowywaczu stołowym przed załadowaniem do różnicowego kalorymetru skaningowego lub DSC. Odkręć uchwyt dociskowy od DSC. Następnie poprowadź silikonową rurkę z bufora roboczego i przymocuj ją do przedniego kołnierza kapilary odniesienia.

Utwórz most między kapilarą odniesienia a kapilarą próbki, łącząc tylny kołnierz odniesienia z przednim kołnierzem próbki. Następnie przymocuj kawałek silikonowej rurki do tylnego kołnierza próbki, który biegnie do kolby na odpady z dołączonym przewodem próżniowym. Włącz linię podciśnieniową, aby przepłukać DSC 200 mililitrami działającego buforu.

Zacznij od przymocowania około 3-5-centymetrowych odcinków silikonowej rurki do referencyjnych kołnierzy kapilarnych. Następnie włóż 1-mililitrową końcówkę pipety do silikonowej rurki tylnego kołnierza. Pobrać 0,8 mililitra buforu roboczego za pomocą pipety i włożyć końcówkę pipety z buforem do silikonowej rurki przedniego kołnierza odniesienia.

Delikatnie dociśnij tłok pipety w dół, aby przepuścić bufor roboczy przez przednią silikonową rurkę do kapilary referencyjnej i w górę do dołączonej końcówki pipety na tylnym kołnierzu. Dociśnij tłok pipety w dół, aż poziom bufora roboczego osiągnie wysokość tuż nad przednim silikonowym rurką. Następnie zwolnij tłok pipety, aż poziom bufora roboczego osiągnie poziom tuż nad tylną rurką silikonową. Kontynuuj przepuszczanie buforu roboczego tam iz powrotem w kapilarze odniesienia, aby usunąć objętość pęcherzyków.

Następnie nakryj tylną końcówkę pipety palcem wskazującym i delikatnie pociągnij tylną końcówkę pipety i przednią pipetę, aby wyjąć je z kołnierzy odniesienia z dołączoną silikonową rurką. Załadować kapilar próbki buforem roboczym jak poprzednio.

Umieść czarną plastikową nasadkę na tylnym odnośniku i sample kołnierze, pozostawiając przednie kołnierze odkryte. Przymocuj uchwyt dociskowy do DSC, a następnie otwórz oprogramowanie DSC i zwiększ ciśnienie w przyrządzie, klikając czerwoną strzałkę "W górę" u góry interfejsu, gdy odczyt mocy się ustabilizuje. Moc DSC jest wskazywana w polu w prawym górnym rogu interfejsu, wraz z odczytem temperatury i ciśnienia przyrządu.

Zrównoważ DSC z buforem roboczym, wykonując skanowanie do przodu i do tyłu. W zakładce "Metoda eksperymentalna" po lewej stronie ekranu upewnij się, że wybrana jest opcja "Skanowanie", aby uruchomić DSC w trybie skanowania temperatury.

W polu "Parametry temperatury" w zakładce "Metoda eksperymentalna" kliknij przycisk grzania. Wprowadź 1 i 100 stopni Celsjusza dla dolnej i górnej temperatury eksperymentalnej, 1 stopień Celsjusza na minutę dla szybkości skanowania i 60 sekund dla okresu równowagi. Kliknij przycisk "Dodaj serię" pod polem wprowadzania dla okresu równowagi. Wpisz 2 w polu "Kroki, aby dodać" w wyskakującym okienku i zaznacz pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Kliknij "OK".

Dodane skany pojawiają się w dolnej części interfejsu. Sprawdź, czy parametry każdego skanowania są zgodne z oczekiwaniami. Rozpocznij eksperyment, klikając zielony przycisk "Odtwórz" u góry interfejsu. Przejdź do żądanego okna i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać eksperyment w wyskakującym okienku. Aby sprawdzić postęp eksperymentu, kliknij kartę "Dane" po prawej stronie karty "Metoda eksperymentu".

Uruchom eksperymenty referencyjne w celu odjęcia linii bazowej danych próbki, ponownie ładując DSC z buforem roboczym w obu naczyniach włosowatych. Zbierz wiele skanów do przodu i do tyłu w odpowiednim zakresie temperatur przy 1 stopniu Celsjusza na minutę z górnym czasem równowagi wynoszącym 120 sekund.

Usuń poprzednie skany równoważenia bufora z dolnej części interfejsu, podświetlając każdy z nich osobno i klikając czerwony "X" w prawym środkowym rogu interfejsu.

Dodaj nowe skany, klikając przycisk "Dodaj serię", wpisując 20 w polu "Kroki do dodania" i zaznaczając pole "Alternatywne ogrzewanie/chłodzenie". Następnie kliknij "OK" i uruchom eksperyment, klikając zielony przycisk "Odtwórz", jak poprzednio.

Powtórzyć te kroki z buforem roboczym zawierającym pożądane stężenie ligandu w obu naczyniach włosowatych, aby uzyskać doświadczenia referencyjne dla liganda. Zbierz dwa oddzielne eksperymenty, które zostaną wykorzystane do uzyskania stałej szybkości dla termolabilnej konwersji liganda.

W przypadku swobodnego zestawu danych biomolekuł należy upewnić się, że kapilara referencyjna zawiera bufor roboczy, podczas gdy kapilara próbki zawiera wolną biomolekułę w pożądanym stężeniu w buforze roboczym. Następnie uruchom przykładowe eksperymenty przy użyciu tej samej procedury ładowania DSC i parametrów eksperymentalnych, które są używane w skanach referencyjnych.

W przypadku doświadczeń związanych z ligandem należy upewnić się, że ligand znajduje się w buforze roboczym w kapilarze odniesienia, a biomolekuła i ligand znajdują się w buforze roboczym w kapilarze próbki. Przepłukać układ między dodatkami różnych ligandów, jak poprzednio.

Wykonaj jeden dodatkowy eksperyment z biomolekułą związaną z ligandem termolabilnym, w którym okres równowagi wysokotemperaturowej wydłuża się do 600 sekund, a wszystkie inne parametry eksperymentalne są takie same jak poprzednio. Przejdź do przetwarzania i analizy danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.