Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Monomery aktyny polimeryzują w sposób od głowy do ogona, tworząc cienkie włókna, zwane mikrofilamentami. Podobnie dimery tubulinowe polimeryzują w dłuższe puste cylindryczne mikrotubule. Te elementy cytoszkieletu utrzymują kształt komórki i ułatwiają ruchliwość komórek.

Aby zobrazować dynamikę sprzężenia aktyna-mikrotubula za pomocą całkowitej mikroskopii wewnętrznego odbicia, TIRF, należy użyć niestandardowego zestawu do obrazowania.

Zespół obrazowania składa się z dwóch szkiełek nakrywkowych: górnego szkiełka nakrywkowego pokrytego silanem m-PEG i dolnego szkiełka nakrywkowego pokrytego silanem biotyny. Oba szkiełka nakrywkowe są rozmieszczone wzdłużnie za pomocą dwustronnej taśmy klejącej i uszczelnione na obu końcach, aby utworzyć kanał przepływowy.

Odpipetować BSA do kanału przepływowego, aby zalać komorę. Dodaj roztwór streptawidyny i inkubuj. Cząsteczki streptawidyny wiążą się z cząsteczkami biotyny przyłączonymi do PEG-silanu dolnego szkiełka nakrywkowego.

Wlej bufor TIRF do kanału. Dodaj roztwór mieszający cytoszkielet zawierający nieznakowane i zielone dimery tubuliny znakowane fluoroforem, wraz z nieznakowanymi, znakowanymi biotyną i fioletowymi monomerami aktyny znakowa