Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Monomery aktyny polimeryzują w sposób od głowy do ogona, tworząc cienkie włókna, zwane mikrofilamentami. Podobnie dimery tubulinowe polimeryzują w dłuższe puste cylindryczne mikrotubule. Te elementy cytoszkieletu utrzymują kształt komórki i ułatwiają ruchliwość komórek.

Aby zobrazować dynamikę sprzężenia aktyna-mikrotubula za pomocą całkowitej mikroskopii wewnętrznego odbicia, TIRF, należy użyć niestandardowego zestawu do obrazowania.

Zespół obrazowania składa się z dwóch szkiełek nakrywkowych: górnego szkiełka nakrywkowego pokrytego silanem m-PEG i dolnego szkiełka nakrywkowego pokrytego silanem biotyny. Oba szkiełka nakrywkowe są rozmieszczone wzdłużnie za pomocą dwustronnej taśmy klejącej i uszczelnione na obu końcach, aby utworzyć kanał przepływowy.

Odpipetować BSA do kanału przepływowego, aby zalać komorę. Dodaj roztwór streptawidyny i inkubuj. Cząsteczki streptawidyny wiążą się z cząsteczkami biotyny przyłączonymi do PEG-silanu dolnego szkiełka nakrywkowego.

Wlej bufor TIRF do kanału. Dodaj roztwór mieszający cytoszkielet zawierający nieznakowane i zielone dimery tubuliny znakowane fluoroforem, wraz z nieznakowanymi, znakowanymi biotyną i fioletowymi monomerami aktyny znakowanymi fluoroforem.

Następnie dodaj roztwór reakcyjny zawierający ATP - środek wspomagający polimeryzację aktyny i GTP - środek promujący polimeryzację tubuliny oraz białko sprzęgające aktyna-mikrotubule. Inkubować.

Dimery tubuliny wiążą się z cząsteczkami GTP i polimeryzują, podczas gdy monomery aktyny wiążą się z cząsteczkami ATP i polimeryzują, tworząc odpowiednio mikrotubule i mikrofilamenty.

Umieść zestaw do obrazowania pod mikroskopem TIRF. Wzbudzić fluorofory laserami o odpowiednich długościach fal

Światło wzbudzenia odbija się wewnętrznie i tworzy pole świetlne, które selektywnie oświetla fluorofory w ograniczonym obszarze w pobliżu granicy faz szkło-woda, gdzie znajdują się dwa ośrodki o różnych współczynnikach załamania światła. W tym regionie mikrowłókna wydają się fioletowe, a mikrotubule wydają się zielone.

Wytnij 12 pasków dwustronnej taśmy z podwójnym podkładem na długość 24 milimetrów. Usuń jedną stronę podkładu taśmy i przymocuj kawałki taśmy przylegające do sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania. Usuń drugi kawałek podkładu taśmy, aby odsłonić lepką stronę taśmy wzdłuż każdego rowka komory, a następnie umieść komorę taśmą do góry na czystej powierzchni.

Wymieszaj roztwory żywicy epoksydowej i utwardzacza, jeden do jednego w małej łódce wagowej i użyj końcówki P1000, aby umieścić kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej między paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania. Następnie umieść taśmę komorową lub stronę epoksydową do góry na czystej powierzchni.

Usunąć powlekane szkiełko nakrywkowe z inkubatora o temperaturze 70 stopni Celsjusza i spłukać powlekane i niepowlekane powierzchnie szkiełek nakrywkowych wodą podwójnie destylowaną sześć razy. Osuszyć przefiltrowanym azotem gazowym, a następnie przymocować do komory obrazowania stroną z powłoką szkiełka nakrywkowego w kierunku taśmy.

Użyj końcówki do pipety P200 lub P1000, aby wywrzeć nacisk na powierzchnię taśmy-szkło, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować zmontowane komory w temperaturze pokojowej przez co najmniej pięć do 10 minut, aby żywica epoksydowa mogła całkowicie uszczelnić ściany komory przed użyciem.

Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12 do 18 godzin od montażu. Użyj pompy perfuzyjnej i sekwencyjnie wymieniaj roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej, przepływając 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zalać komorę obrazowania.

Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika armatury Luer-lock. Następnie przelej 50 mikrolitrów po 0,005 miligrama na mililitr streptawidyny i inkubuj przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.

Przelej 50 mikrolitrów 1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubuj przez 10 do 30 sekund. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika. Następnie przelej 50 mikrolitrów ciepłego buforu 1x TIRF, a następnie 50 mikrolitrów stabilizowanych i 50% biotynylowanych nasion mikrotubul, rozcieńczonych w 1x buforze TIRF.

Ustaw stage lub obiektyw urządzenia grzewczego tak, aby utrzymywał temperaturę od 35 do 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej. Następnie ustaw interwał akwizycji co pięć sekund przez 15 do 20 minut. Następnie ustaw ekspozycję lasera 488 i 647 na 50 do 100 milisekund przy mocy od 5% do 10%, najpierw dostosowując reakcję polimeryzacji, aby zainicjować montaż filamentu aktynowego.

Uzyskaj obrazy w 647 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt. Następnie dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej kondycjonowanej studzience perfuzyjnej, aby zainicjować montaż mikrotubul. Wizualizuj w 488 nanometrach i dokonaj odpowiednich korekt.

Połącz trzy mikrolitry 10-mikromolowej tubuliny 488 z 7,2 mikrolitrową podwielokrotnością 100-mikromolowej fluorescencyjnie nieznakowanej tubuliny, nie później niż 15 minut przed użyciem. Następnie połącz trzy mikrolitry rozcieńczonej biotynylowanej aktyny w odpowiednich objętościach fluorescencyjnie nieznakowanej i znakowanej aktyny, tak aby końcowa mieszanina wynosiła 12,5 mikromolowej całkowitej aktyny, z 10% do 30% znacznikiem fluorescencyjnym.

Przygotuj mieszaninę cytoszkieletu, łącząc dwa mikrolitry 12,5-mikromolowej mieszanki aktyny z mieszanką tubuliny, nie później niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.

Przygotuj mieszankę reakcji białkowych, łącząc wszystkie inne eksperymentalne składniki i białka, w tym 2x bufor TIRF, anty-wybielacz, nukleotydy, i białka pomocnicze. Inkubować mieszaninę cytoszkieletu w mieszance reakcji białkowej oddzielnie, w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 sekund.

Aby zainicjować reakcję, dodaj zawartość mieszanki reakcji białkowej do mieszanki cytoszkieletu i wymieszaj ją. Przepłynąć 50 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony 15 mikromolowymi wolnymi tubulinami, jednym milimolowym GTP, 0,5 mikromolowymi monomerami aktyny i odpowiednimi objętościami kontrolnych do komory perfuzyjnej.

Nagraj film poklatkowy za pomocą oprogramowania mikroskopowego, aby rejestrować co pięć sekund, przez 15 do 20 minut. Kondycjonuj nową studzienkę perfuzyjną i zastąp objętość buforu białkiem regulatorowym będącym przedmiotem zainteresowania i kontrolą buforu. Acquire w celu oceny białek regulatorowych dla pojawiających się funkcji mikrotubul aktyny.