Mikroskopia świetlna w sieci do wizualizacji interakcji receptor-ligand w żywych komórkach

Mikroskopia świetlna kratowa, LLSM, umożliwia wizualizację oddziaływań receptor-ligand na powierzchni komórki w żywych komórkach z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Weź szkiełko nakrywkowe zawierające transdukowane komórki wyrażające ligand, emitujące czerwoną fluorescencję. Przymocuj szkiełko nakrywkowe komórką do góry na natłuszczonym uchwycie na próbkę. Zamocuj uchwyt na piezoelektrycznym stoliku mikroskopu, aby umożliwić precyzyjne pozycjonowanie próbki i skanowanie podczas obrazowania. Dostosuj ustawienia oprogramowania, aby skupić się na pojedynczej komórce wykazującej ekspresję ligandu.

Odpipetować zawiesinę komórkową wykazującą ekspresję receptora na szkiełko nakrywkowe. Receptory są znakowane zielonymi przeciwciałami znakowanymi fluoroforem. Wyobraź sobie oddziałujące pary komórek.

Laser wzbudzający mikroskopu emituje okrągłą, liniowo spolaryzowaną wiązkę laserową, która przechodzi przez cylindryczne soczewki, tworząc arkusz świetlny. Arkusz świetlny jest rzutowany na modulator, który usuwa nadmiar dyfrakcji i przekształca go w ultracienki wzór sieciowy.

Siatkowy arkusz świetlny oświetla ultracienki wycinek oddziałującej pary komórek, a fluorescencja emitowana przez oddziałujące komórki jest wychwytywana prostopadle do padającej wiązki. Zobrazuj oddziałującą parę komórek w wielu płaszczyznach Z i uchwyć dwuwymiarowe obrazy w każdej płaszczyźnie ogniskowej za pomocą szybkiej kamery.

Korzystając z odpowiedniego oprogramowania, połącz te obrazy, aby utworzyć z-stack – czterowymiarowy obraz o wysokiej rozdzielczości demonstrujący czasoprzestrzenną dynamikę interakcji receptor-ligand na powierzchni komórki.

Do kąpieli LLSM dodać 10 mililitrów wody i 30 mikrolitrów fluoresceiny. Najpierw naciśnij Obraz (Strona główna), aby przesunąć obiekt do pozycji obrazu i spójrz na wzór wiązki laserowej pojedynczego naczynia.

Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnicy i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania, aby wiązka była cienkim wzorem, który jest zrównoważony we wszystkich kierunkach. Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza. Użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, mikrometru górnej ostrości i koloru obiektywu, aby wyregulować wiązkę.

Następnie umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 mililitrami wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę.

Aby wyświetlić standardowe koraliki fluorescencyjne, włącz funkcję Dither, ustawiając wartość 3 w polu "X Galvo Range" i naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole. Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kolor obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości. Następnie dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów skanowania obiektywem, Z galvo, Z plus obiektywu i skanowania próbki. Następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki, aby zebrać funkcję rozrzutu punktów próbkowania w celu skorygowania i dekonwolucji. Przełącz lasery w tryb trójkolorowy i ponownie naciśnij przycisk Wykonaj.

Na początek dodaj 100 000 komórek prezentujących antygen do przygotowanego okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 milimetrów i pozwól im osiąść przez 10 minut. Nasmaruj uchwyt próbki i dodaj do niego szkiełko nakrywkowe Komórką do góry.

Następnie dodaj kroplę nośnika do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego. Przykręć uchwyt próbki do piezo i naciśnij Obraz (Strona główna). Znajdź komórkę prezentującą antygen do zobrazowania i upewnij się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania działają prawidłowo.

Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki. Znajdź środek komórki prezentującej antygen, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij Stop, aby zatrzymać laser. Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia. Naciśnij Enter, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj, aby zebrać dane.

Obniż stolik do pozycji obciążenia i dodaj 50 mikrolitrów limfocytów T do podłoża obrazowego kroplami, bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym. Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś scenę do tyłu, klikając pozycję Obraz (powrót).

Rozpocznij obrazowanie. Pamiętaj, aby ustawić żądany stos Z i długość timelapse. Na przykład wyobraź sobie 60 stosów Z w kroku co 0,4 mikrometra i wprowadź 500-te ramki. Zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć fotowybielania. Użyj trybu Na żywo, aby wyszukać pary komórek, a gdy zostaną wprowadzone gotowe i żądane ustawienia, naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane.