Mikroskopia ciemnego pola do wizualizacji dynamiki dyfuzyjnej nanoprętów na błonie komórkowej

Aby zbadać dynamikę dyfuzji nanoprętów złota na żywej błonie komórkowej za pomocą mikroskopii ciemnego pola, DFM, w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząstek, należy rozpocząć od wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego w naczyniu hodowlanym zawierającym odpowiednią pożywkę. Dodać zawiesinę komórek na szkiełko nakrywkowe. Pożywka ułatwia wzrost komórek.

Inkubuj z dodatnio naładowanymi nanoprętami złota, które adsorbują się na ujemnie naładowanej błonie komórkowej poprzez oddziaływania elektrostatyczne. Odpipetować pożywkę z naczynia do rowka szkiełka podstawowego. Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na rowku i uszczelnij.

Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu ciemnego pola. Mikroskop oświetla próbkę ukośnym światłem o wysokim kącie przechodzącym przez specjalistyczny kondensor ciemnego pola.

Po oświetleniu nanoprętów, wolne elektrony na powierzchni nanopręta oscylują z częstotliwością rezonansową z padającym światłem. Oscylujące elektrony rozpraszają światło o określonej długości fali uchwyconej przez soczewkę obiektywu, umożliwiając wizualizację nanoprętów.

Podobnie błona komórkowa – składająca się z lipidów i białek – rozprasza padające światło o wyższym współczynniku załamania światła niż otaczający ośrodek, tworząc jasny obraz na ciemnym tle. Przechwytywanie obrazów DFM szeregów czasowych.

Za pomocą odpowiedniego oprogramowania przeprowadź analizę śledzenia pojedynczych cząstek na obrazach DFM, aby zobrazować dyfuzję nanoprętów przez błonę komórkową z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Zacznij od spalenia na ogniu szkiełka nakrywkowego zanurzonego w etanolu i umieszczenia szkiełka nakrywkowego w naczyniu do hodowli komórkowych o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającym 2 mililitry pożywki do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej. Dodaj 50 mikrolitrów interesującej nas zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe i delikatnie potrząsaj naczyniem w przód iw tył oraz w lewo i w prawo, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych na około 12 godzin, aż komórki osiągną zbieżność od 20% do 40%, a następnie dodaj do naczynia 20 mikrolitrów złotych nanoprętów pokrytych CTAB. Po delikatnym wstrząśnięciu w celu równomiernego rozprowadzenia nanoprętów na naczyniu, umieść naczynie w wilgotnej atmosferze na 5 minut.

Pod koniec inkubacji powoli przenieś 100 mikrolitrów supernatantu z naczynia do rowka szkiełka podstawowego i ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na rowku szkiełka. Następnie uszczelnij krawędź szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozostaw lakier do wyschnięcia przed umieszczeniem szkiełka na stoliku mikroskopu ciemnego pola.

W celu śledzenia pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii ciemnego pola, umieść kroplę oleju na zanurzonym w oleju kondensatorze ciemnego pola i przekręć pokrętło, aż kondensator zetknie się ze szklanym szkiełkiem. Umieść kroplę oleju na górnej części szkła nakrywkowego i obracaj pokrętłem ostrości, aż obiektyw zanurzający się w oleju 60x dotknie oleju.

Włącz źródło światła i lekko przekręć pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość na płaszczyźnie obrazowania. Następnie kliknij ikonę kamery w oprogramowaniu mikroskopu, aby zarejestrować szereg czasowy obrazu rozpraszania światła próbki za pomocą kolorowej kamery CMOS i zapisać obraz w formacie TIFF.

Aby wyodrębnić pojedynczą trajektorię długoterminową, otwórz obraz w ImageJ i kliknij Obraz | Typ | i 8-bitowy, aby przekonwertować obraz z trybu RGB na tryb 8-bitowy. Aby dostosować kontrast, kliknij Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast i ustaw parametry. Wybierz cząstkę docelową i użyj "Control + X", aby odciąć tło szeregów czasowych.

Kliknij Wtyczki | Particle Tracker Classic | i Particle Tracker, aby otworzyć okno wykrywania i łączenia cząstek i ustawić promień na 6, punkt odcięcia na 0, a percentyl na 0,01%. Ustaw zakres połączenia na 10, a przemieszczenie na 10, a następnie kliknij "OK", aby otworzyć okno wyników śledzenia cząstek, aby zobaczyć wyniki.

Kliknij "Wizualizuj wszystkie trajektorie", aby sprawdzić wygenerowane trajektorie. Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie i trajektoria ruchu nanoprętów złota są zgodne, kliknij "Zapisz pełny raport", aby zapisać wyniki. Jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie nie pasuje do trajektorii ruchu złotych nanoprętów, kliknij "Połącz ponownie cząstki", aby ponownie połączyć wykryte cząstki o różnych parametrach łącza i percentyla.