Dlaczego pomiar kinetyki rozplatania DNA ma znaczenie dla walidacji celu terapeutycznego?

Pomiar kinetyki rozplatania DNA zapewnia bezpośredni odczyt funkcjonalny stabilności nukleosomów, umożliwiając ilościową ocenę zaangażowania celu epigenetycznego. Pomiar ten wspomaga walidację celu poprzez powiązanie zmian biofizycznych z efektami transkrypcyjnymi w systemach istotnych dla chorób. Dane kinetyczne umożliwiająB redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie, w jaki sposób związki wpływają na dostępność chromatyny w czasie.

W jaki sposób wyizolowanie nukleosomu jako niezależnej zmiennej wpisuje się w schemat procesu odkrywczego?

Izolacja nukleosomów na funkcjonalizowanym podłożu z miki umożliwia kontrolowaną obserwację rozwijania się DNA bez wpływu zakłócających czynników komórkowych. To redukcjonistyczne podejście sprzyja wczesnym etapom odkryć, zapewniając zdefiniowany system do testowania wpływu związków na podstawowe mechanizmy chromatyny. Izolowany system wspiera rozwój testów, dostarczając powtarzalne, ilościowe wyniki dla kampanii przesiewowych.

Jakie ilościowe pomiary zależnych zmiennych umożliwiają identyfikację związków wiodących?

Pomiary wysokości nukleosomów w funkcji czasu służą jako zmienna zależna do ilościowego określania zdarzeń i kinetyki rozwijania DNA. Pomiary te umożliwiają identyfikację związków wiodących poprzez bezpośrednie porównanie wpływu różnych związków na stabilność i dynamikę nukleosomów. Wyniki ilościowe wspierają analizę zależności struktura-aktywność poprzez korelację modyfikacji chemicznych ze zmianami w zachowaniu chromatyny.

Dlaczego wymagania dotyczące replikacji są istotne dla współpracy międzyfunkcyjnej?

Wymagania dotyczące replikacji zapewniają spójną immobilizację nukleosomów i warunki obrazowania we wszystkich eksperymentach, co jest niezbędne dla wiarygodnej wymiany danych między zespołami. Ustandaryzowane protokoły funkcjonalizacji miki i wymiany buforu umożliwiają uzyskanie powtarzalnych wyników, które wspierają wspólne wysiłki w zakresie walidacji celów. Spójna replikacja zmniejsza zmienność w pomiarach kinetycznych, zwiększając pewność interpretacji danych w ramach różnych projektów.

Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem?

Implementacja wymaga możliwości przeprowadzenia analizy kinetycznej danych time-lapse, w tym wykrywania zdarzeń oraz wyznaczania stałych szybkości na podstawie trajektorii wysokości nukleosomów. Niezbędne są narzędzia statystyczne do ilościowego określenia częstotliwości rozwijania, czasów przebywania oraz szybkości przejść między stanami owiniętym i rozwiniętym. Możliwości analityczne te pozwalają zespołom porównywać warunki i oceniać efekty działania związków z rygorem odpowiednim do podejmowania decyzji.

Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowych w celu uchwycenia dynamiki nukleosomów

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniki biologiczne

0 wyświetleń • 4:56 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nukleosomy - powtarzające się jednostki eukariotycznego DNA - składają się z segmentów DNA owiniętych wokół rdzeni białek histonowych. Rozpakowywanie DNA wokół rdzenia histonowego ma kluczowe znaczenie dla dynamiki nukleosomów.

Aby uchwycić dynamikę nukleosomów, zacznij od gładkiego, funkcjonalizowanego substratu mikowego zamontowanego na mikroskopie sił atomowych, AFM, stoliku skanera. Pokryj substrat buforem zawierającym nukleosomy.

Ujemnie naładowane DNA nukleosomu oddziałuje z dodatnimi ładunkami na funkcjonalizowanej mice, unieruchamiając je na powierzchni. Przemyj unieruchomiony substrat miki buforem, aby zapobiec przepełnieniu nukleosomów.

Przenieś stopień skanera zawierającego nukleosomy do komory obrazowania zawierającej wstępnie zamontowany wspornik, z końcówką na krawędzi i skierowaną do góry w kierunku nukleosomów.

Napełnij komorę buforem obrazowania. Ustaw wiązkę laserową na tylnym wsporniku, aby zapewnić dokładne pomiary ugięcia.

Końcówka AFM oscyluje blisko w pełni owiniętych nukleosomów i skanuje powierzchnię, aby mierzyć wysokość nukleosomów w regularnych odstępach czasu.

Spontaniczne odwijanie DNA zwiększa wysokość nukleosomów, zmieniając oscylacje końcówki i prowadząc do ugięcia kantylowego. To odchylenie wspornika przesuwa pozycję odbitej wiązki laserowej, która jest wykrywana przez detektor czuły na położenie i tworzy topograficzne obrazy nukleosomów.

Na obrazach AFM rdzeń histonowy pojawia się jako świecąca plama z nieopakowanym DNA o rosnącej wysokości w miarę upływu czasu, co wskazuje na dynamikę nukleosomów.

Użyj kleju do skanera prętów szklanych, aby przymocować szklany pręt do stolika skanera AFM. Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 10 minut. W międzyczasie wykonaj okrągłe kawałki miki o grubości 0,1 milimetra i średnicy 1,5 milimetra, wykrawając je z większego arkusza miki. Użyj kleju do prętów ze szkła mikowego AFM o dużej prędkości, aby przymocować ten kawałek miki do szklanego pręta na szybkobieżnym AFM i pozostaw go nietkniętym przez co najmniej 10 minut, aż wyschnie.

Następnie odetnij warstwy od miki za pomocą taśmy wrażliwej na nacisk, aż na taśmie pojawi się dobrze rozcięta warstwa. Następnie rozcieńczyć 1 mikrolitr 50-milimolowego materiału APS w 99 mikrolitrach destylowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać 500-mikromolowy roztwór APS. Umieść 2,5 mikrolitra roztworu na świeżo rozciętej powierzchni miki i pozwól powierzchni funkcjonalizować się przez 30 minut.

Po inkubacji kilkakrotnie przepłukać mikę destylowaną wodą dejonizowaną, stosując płukanki o pojemności 3 mikrolitrów. Po każdym płukaniu całkowicie usuń wodę, umieszczając chusteczkę z włókniny na krawędzi miki. Po ostatnim płukaniu umieść 3 mikrolitry destylowanej wody dejonizowanej na powierzchni i pozostaw na co najmniej 5 minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane APS.

Następnie umieść sondę w uchwycie AFM o dużej prędkości i umieść uchwyt na stoliku AFM końcówką skierowaną do góry. Opłucz uchwyt za pomocą 100 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej, a następnie przepłucz dwa 100-mikrolitrowe płukania 0,22-mikronowego przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów. Po zakończeniu płukania napełnij komorę 100 mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, zanurzając końcówkę.

Dostosuj pozycję wspornika, aż zostanie uderzony laserem. Następnie przepłucz mikę APS pięciokrotnie przefiltrowanym buforem do obrazowania nukleosomów, używając 4 mikrolitrów na płukanie. Rozcieńczyć 1 mikrolitr materiału montażowego nukleosomów w 250 mikrolitrach przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, aby uzyskać końcowe stężenie nukleosomów 1 nanomolowe.

Umieść 2,5 mikrolitra tego rozcieńczenia na powierzchni i pozostaw na 2 minuty. Dwukrotnie spłucz powierzchnię 4 mikrolitrami buforu do obrazowania nukleosomów, aby uniknąć przepełnienia. Po ostatnim płukaniu pozostaw powierzchnię pokrytą buforem obrazowania. Umieść skaner i próbkę na uchwycie końcówki tak, aby próbka była skierowana stroną zadrukowaną do dołu.

Aby rozpocząć podejście, należy użyć funkcji automatycznego podejścia z amplitudą punktu zadanego zbliżoną do amplitudy drgań swobodnych. Dostosuj nastawę, aż powierzchnia będzie dobrze śledzona. Następnie ustaw obszar obrazu około 150 na 150 nanometrów na 200 na 200 nanometrów z szybkością akwizycji danych około 300 milisekund na klatkę obrazowania.