Transmisyjna mikroskopia elektronowa w celu ilościowego określenia dystrybucji glikogenu w ludzkich mięśniach szkieletowych

Glikogen, rozgałęziony polimer glukozy, jest rezerwą energii w subkomórkowych przedziałach międzymiofibrylarnych, wewnątrzmiofibrylarnych i podsarkolemmalnych w ludzkich mięśniach szkieletowych.

Aby określić ilościowo subkomórkową dystrybucję glikogenu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, TEM, należy uzyskać izolowaną ludzką tkankę mięśni szkieletowych. Utrwalić aldehydem glutarowym, aby zachować strukturę tkanki. Umieść tkankę w roztworze tetratlenku osmu i żelazocyjanku potasu.

Zredukowany kompleks osmowo-żelazocyjankowy wiąże się z grupami hydroksylowymi w glikogenie, poprawiając kontrast cząsteczek glikogenu w mięśniach. Dodatkowo błony i retikulum sarkoplazmatyczne - organelle związane z błoną - ulegają zabarwieniu.

Odwodnić tkankę w rosnących stężeniach etanolu. Zanurz w żywicy, tworząc solidny blok. Uzyskaj ultracienkie odcinki z podłużnie zorientowanymi włóknami mięśniowymi; przenieść na siatki TEM.

Zanurz siatki w octanie uranylu, roztworze metalu ciężkiego. Jony uranylowe wiążą się z ujemnie naładowanymi lipidami i białkami, dzięki czemu mają gęstość elektronów. Barwienie roztworem cytrynianu ołowiu.

Jony ołowiu wiążą się z obszarami zabarwionymi osmem, w tym z cząsteczkami glikogenu, zwiększając kontrast. Wiążą się również z obszarami reagującymi octanem uranylu, zwiększając nieprzezroczystość elektronów.

Podczas obrazowania TEM, gdy wiązki elektronów przechodzą przez tkankę, barwione obszary o dużej gęstości elektronów, w tym glikogen, rozpraszają więcej elektronów, podczas gdy niebarwione obszary przenoszą elektrony.

Na uzyskanym obrazie TEM o wysokim kontraście cząsteczki glikogenu wydają się wyraźne i ciemne; niebarwione obszary wydają się jaśniejsze, co ułatwia wizualizację i kwantyfikację subkomórkowego rozkładu glikogenu w mięśniach.

Odizoluj małą próbkę z biopsji mięśnia lub całego mięśnia, który ma maksymalną średnicę 1 milimetra w dowolnym kierunku i jest dłuższy wzdłużnie niż w przekroju poprzecznym.

Umieścić próbkę w probówce zawierającej zimny roztwór do utrwalania pierwotnego. Przechowuj w temperaturze 5 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnie przemyć próbkę 4 razy w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu. Za pomocą pipet transferowych usunąć zużyty bufor z probówki, pozostawiając próbkę nietkniętą, a następnie dodać świeży bufor. Po utrwaleniu próbki 1% tetratlenku osmu i 1,5% żelazocyjanku potasu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 120 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Opłucz próbkę dwukrotnie w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze pokojowej. Odwodnić przez zanurzenie w stopniowanej serii etanolu w temperaturze pokojowej. Naciekać próbkę tlenkiem propylenu i mieszaninami żywic eposydowych w temperaturze pokojowej przy użyciu podanych proporcji objętościowych.

Następnego dnia zanurz próbki w 100% świeżej żywicy epossydowej w foremkach i polimeryzuj w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Zamontuj blok próbki na uchwycie ultramikrotomu. Przytnij blok na powierzchni żyletką, aby osiągnąć poziom tkanki. Zamontuj nóż diamentowy przed próbką i wyrównaj powierzchnię próbki równolegle do noża.

Za pomocą noża diamentowego należy wykonać półcienki przekrój o grubości 1 mikrometra, aby sprawdzić orientację próbki. Wybarwić półcienki wycinek błękitem toluidynowym do obserwacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie przytnij blok jeszcze bardziej, aby zmniejszyć obszar zainteresowania, aby uzyskać odpowiednie ultracienkie sekcje.

Wycinaj ultracienkie sekcje o grubości od 60 do 70 nanometrów za pomocą drugiego noża diamentowego. Zbierz od 1 do 2 sekcji na miedzianych siatkach z jednym otworem za pomocą idealnej pętli. W celu kontrastowania sekcji zanurz kratki w roztworze octanu uranylu na 20 minut i umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie zanurz kratki w cytrynianie ołowiu na 15 minut i ponownie umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej.

Włącz transmisyjny mikroskop elektronowy, komputer i oprogramowanie do nagrywania obrazu. Rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą cyfrowej kamery CCD z powolnym skanowaniem i powiązanego oprogramowania do obrazowania. Po włożeniu siatki z wieloma sekcjami do etapu mikroskopu, należy początkowo przesiać siatkę w małym powiększeniu, aby wybrać sekcje najlepszej jakości i określić kierunek włókien mięśniowych.

Następnie skoncentruj obraz w powiększeniu powyżej 30 000, z wiązką wyśrodkowaną na światłowodzie peryferyjnym w przekroju i rejestruj obrazy z 1-sekundowym czasem naświetlania przy żądanym powiększeniu. Upewnij się, że obrazy są rozmieszczone na całej długości i szerokości światłowodu w randomizowanej, ale systematycznej kolejności, aby uzyskać bezstronne wyniki, i powtarzaj obrazowanie, aż zobrazowanych zostanie od 6 do 10 włókien.

Zaimportuj obrazy do imageJ, klikając Plik, a następnie Otwórz. Ustaw skalę globalną, aby dopasować ją do oryginalnego rozmiaru obrazu, klikając Analizuj, a następnie Ustaw skalę. Aby powiększyć o 100%, kliknij Obraz, przejdź do Powiększenie i kliknij W.

Zmierz grubość jednego dysku Z na obraz przestrzeni miofibrylarnej za pomocą narzędzia Linia prosta z menu Narzędzia i oblicz średnią grubość dysku Z każdego z 6 do 10 włókien. Użyj narzędzia Linia segmentowana, aby zmierzyć długość najbardziej zewnętrznej miofibryli, widocznej tuż poniżej obszaru podsarkolemmalnego.

Aby wstawić siatkę, kliknij pozycję Analizuj, wybierz pozycję Narzędzia, a następnie wybierz pozycję Siatka. Teraz ustaw obszar na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień w ramach dostępnej długości na 12 obrazach podsarkolemmalnych, w których krzyż uderza w glikogen podsarkolemmalny.

Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz Narzędzia, a następnie Siatka i ustaw Obszar na punkt na 160 000 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną.

Następnie ponownie, aby wstawić siatkę, kliknij pozycję Analizuj, wybierz pozycję Narzędzia, a następnie wybierz pozycję Siatka. Teraz ustaw obszar na punkt na 3,600 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen wewnątrzmiofibrylarny.

Wstaw siatkę, klikając Analizuj, a następnie wybierz Narzędzia, a następnie Siatka i ustaw Obszar na punkt na 32 400 nanometrów kwadratowych. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen międzymiofibrylarny.

Korzystając z siatki o powierzchni 32 400 nanometrów kwadratowych, aby losowo wybrać cząsteczki glikogenu, zacznij od lewego górnego kwadratu i w razie potrzeby przesuń w lewo. Za pomocą narzędzia Linia prosta zmierz średnicę 5 losowo wybranych cząstek glikogenu z każdej puli dla każdego z 12 obrazów, aby uzyskać średnio 60 cząstek na pulę na włókno.