Bezpośredni test immunologiczny oparty na spektroskopii Ramana w celu wykrycia określonego antygenu

Zacznij od inkubacji cząsteczek barwnika reporterowego Ramana z nanocząstkami złota, aby reportery związały się z nanocząstkami.

Dodać glikol polietylenowy, przeciwciała sprzężone z PEG specyficzne dla antygenu docelowego. Przeciwciała kowalencyjnie przyłączają się do nanocząstek poprzez wiązanie złoto-dwusiarczkowe. Dodaj PEG sprzężone z tiolami, aby zablokować pozostałe miejsca nanocząstek i zapobiec agregacji nanocząstek, tworząc sondy nanocząsteczkowe.

Pokryj płytki do testów immunologicznych studzienkami z docelowym antygenem. Zablokuj pozostałe miejsca płytki roztworem zawierającym białka. Dodaj sondy nanocząstek. Wykonaj seryjne rozcieńczanie sondy w poprzek dołków. Inkubuj, aby przeciwciała w sondach związały się z antygenami, tworząc kompleksy.

Użyj mikroskopu Ramana, aby określić odpowiedź optyczną sondy. Padający monochromatyczny laser wzbudza elektrony powierzchniowe nanocząstek złota i powoduje ich oscylacje, tworząc silne lokalne pole elektromagnetyczne na powierzchni sondy.

Padająca wiązka i reporterzy Ramana oddziałują ze sobą, powodując wzmocnione nieelastyczne światło lub rozpraszanie Ramana o różnych długościach fal i częstotliwościach z powodu wzmocnionego pola elektromagnetycznego. Nieelastycznie emitowany sygnał Ramana służy do generowania widma Ramana.

Wykreśl obszar widmowy piku reporterowego Ramana w stosunku do stężenia sondy, aby znaleźć dolną granicę wykrywania sondy i ułatwić bardziej czułe wykrywanie antygenu.

W celu przygotowania sond Ramanowskich należy najpierw wykonać dwie 1,5-mililitrowe partie nanocząstek złota i reporter Ramana w stężeniach określonych zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym.

Odbywa się to poprzez połączenie roztworów reportera Ramana i nanocząstek złota i umożliwienie im wiązania się przez ponad 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj pegylowany roztwór przeciwciała do jednego z roztworów nanocząstek złota związanych z reporterem, aby uzyskać stosunek przeciwciał do cząstek 200 do 1. To rozwiązanie będzie dotyczyło próbek testowych.

W oddzielnej probówce do mikrowirówki dodać pegylowany antygen do drugiego roztworu nanocząstek złota związanego z reporterem w stosunku 200 do 1 antygenu do cząstek, które mają być użyte jako kontrola. Inkubować oba roztwory przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie zablokuj pozostałe miejsca na powierzchni nanocząstek. Aby to osiągnąć, najpierw rozpuść stały tiol glikolu metoksypolietylenowego do stężenia 200 mikromolów za pomocą wody HPLC. Wirować roztwór, aż tiol całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj roztwór tiolu w stosunku 40 000 do 1 do roztworów przeciwciał PEG związanych z nanocząstkami i inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby upewnić się, że pozostałe miejsca na nanocząsteczce złota są zablokowane.

Następnie odzyskaj funkcjonalizowane sondy Ramana poprzez odwirowanie cząstek w probówkach wirówkowych o niskim związaniu, tak aby supernatant był klarowny. Usunąć supernatant przez pipetowanie, ale należy uważać, aby nie naruszyć nanocząstek. Następnie ponownie zasmów nanocząstki za pomocą 1 mililitra PBS.

Oszacuj stężenie nanocząstek złota, wykonując pomiar UV-Visible z około trzech mikrolitrów roztworu i porównaj wyniki ze znanymi stężeniami nanocząstek złota, ponieważ jest to zależność liniowa.

Jeśli nanocząstki nie zostaną wystarczająco zablokowane, będą się agregować z powodu sił adhezji między cząsteczkami, co sugeruje, że odczynniki zostały dodane w niewłaściwych stężeniach. Zwykle roztworem jest głęboki czerwony kolor, ale agregacja tworzy szary odcień.

Dostosuj objętość tak, aby końcowe roztwory miały co najmniej 1 x 10¹¹ cząstek na mililitr i przechowuj roztwory w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż zostaną wykorzystane do funkcjonalizacji płytki do testu immunologicznego. Użyj tych rozwiązań w ciągu jednego tygodnia. Najpierw przygotuj wystarczającą ilość rozcieńczonego antygenu, aby wypełnić studzienki styropianowe. Następnie zwiruj roztwór i natychmiast dodaj roztwór do dołków na płytki.

Pozwól antygenowi związać się z płytkami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar roztworu antygenu, zrzucając roztwór i uderzając talerzem o blat pokryty ręcznikiem papierowym. Dodaj TBST do studzienek, aby umyć powierzchnię. Następnie usuń pranie, ponownie wylewając roztwór i uderzając talerzem o blat pokryty ręcznikiem papierowym.

Następnie zablokuj pozostałe miejsca wiązania na płytce, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, dodając 70 mikrolitrów roztworu blokującego HSA do każdego dołka płytki i inkubując płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie usunąć roztwór blokujący i przepłukać płytkę trzykrotnie TBST, jak pokazano powyżej. Po wyjęciu ostatniego płukania przykryj płytkę i przechowuj ją w suchym miejscu w temperaturze 4 stopni Celsjusza do dalszego użycia.

Dodać 140 mikrolitrów wcześniej przygotowanych nanocząstek sondy do pierwszej kolumny 96-dołkowej płytki, umieszczając badane nanocząstki w pierwszych pięciu rzędach, a nanocząstki kontrolne w ostatnich trzech rzędach. Dodaj 70 mikrolitrów PBS do wszystkich pozostałych kolumn

Rozcieńczyć każdą kolumnę, stosując seryjne rozcieńczenie 1-2. Zacznij od pobrania 70 mikrolitrów z pierwszej kolumny i wymieszania jej z drugą. Następnie weź 70 mikrolitrów z drugiej kolumny i dodaj do trzeciej i tak dalej. Pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej godzinę.

Następnie wyjmij niezwiązane sondy nanocząstek i umyj płytkę TBST pięć razy, jak pokazano wcześniej. Po ostatnim umyciu dodaj 70 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i przykryj płytkę uszczelką płytkową. Sprawdzić, czy próbki kontrolne są czyste. Jeśli wystąpiło niespecyficzne wiązanie, próbki kontrolne będą miały podobny kolor jak próbki testowe.

Używając odwróconego mikroskopu Ramanowskiego, skieruj obiektyw na powierzchnię studni, w której znajdują się sondy nanocząstek złota. Uzyskaj widma ramanowskie studni. Zbierz widmo w zakresie od 1800 centymetrów odwrotnych do 400 centymetrów odwrotnych i powtórz to dla każdej studzienki. Na koniec wykonaj czynności opisane w ostatniej sekcji dołączonego protokołu tekstowego, aby określić czułość konfiguracji.