Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualne zaprezentowanie etapów wykorzystania zestawu do detekcji mycoplasma metodą PCR z linii Lookout, zoptymalizowanego pod kątem wykrywania kontaminacji mycoplasma. Cel ten osiąga się poprzez wstępne podgrzanie próbek do 95 °C w celu inaktywacji cząsteczek DNA, które mogłyby sprawić, że pożądana matryca będzie nieodpowiednia do reakcji PCR. Następnie przygotowuje się próbki do PCR, wykorzystując dostarczone probówki, które są wcześniej zakodowane nukleotydami, starterami oraz DNA kontroli wewnętrznej.

Trzecim krokiem procedury jest cykliczność temperaturowa w warunkach starannie zoptymalizowanych tak, aby uzyskać najwyższą czułość i wyeliminować niespecyficzną amplifikację. Ostatecznie, poprzez ocenę za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, można uzyskać wyniki pozwalające stwierdzić, czy badane próbki są zanieczyszczone mycoplasmas. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że odczynniki są przygotowane wcześniej, a zastosowano wysokiej jakości probówki do PCR.

Dzięki temu proces jest bardziej wygodny i wydajny. Inną zaletą tego zestawu jest to, że do wykrycia kontaminacji wymagane jest mniej niż dwa genomy mycoplasma na mikrolitr próbki. Podczas przeprowadzania procedury wykrywania mycoplasma należy unikać wszelkich możliwych zanieczyszczeń, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej w celu zminimalizowania kontaktu ze skórą, upewniając się, że wszystkie użyte odczynniki są wolne od zanieczyszczeń oraz przez cały czas zachowując właściwą technikę aseptyczną.

Procedurę można przeprowadzić bezpośrednio na supernatantach z hodowli komórkowych lub przygotować próbki do wykorzystania w późniejszym terminie. Aby przygotować próbki do późniejszego użycia, należy przenieść 100 µL każdego supernatantu do sterylnej probówki do amplifikacji i inkubować w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Po inkubacji próbki mogą być przechowywane w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie jeden tydzień.

Bezpośrednio przed analizą próbek należy je krótko odwirować w celu osadzenia szczątków komórkowych. Aby przygotować próbki do PCR, należy w pierwszej kolejności określić całkowitą objętość buforu do rehydratacji polimerazy DNA wymaganą dla reakcji. Jedną jednostkę polimerazy DNA na reakcję należy dodać do odpowiedniej objętości buforu do rehydratacji, która będzie zależeć od użytej polimerazy; w niniejszym pokazie wykorzystana zostanie polimeraza TAC D 93 0 7 w pięciu reakcjach: trzech próbkach, jednej kontroli dodatniej oraz jednej kontroli ujemnej.

Obliczoną objętość polimerazy DNA przenieś do czystej probówki do mikrowirówki, a następnie dodaj obliczoną objętość buforu do rehydratacji. Delikatnie wymieszaj polimerazę DNA z buforem do rehydratacji, lekko potrząsając probówką. Nie mieszaj tej mieszaniny w wirówce typu vortex.

Do przygotowania kontroli negatywnej oraz próbek należy wykorzystać przezroczyste probówki reakcyjne dołączone do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej; do każdej z nich należy pipetować 23 µL wcześniej przygotowanego buforu do rehydratacji polimerazy DNA. Zawartość probówek kontroli negatywnej oraz próbek należy wymieszać.

Następnie dodaj 2 µL wody wolnej od DNA do kontroli negatywnej oraz po 2 µL każdej próbki do odpowiednich probówek z próbkami. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukując probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu typu vortex.

Aby przygotować kontrolę pozytywną, należy użyć różowych probówek reakcyjnych dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej; do probówki reakcyjnej należy dodać 25 µL mieszaniny buforu do rehydratacji polimerazy DNA. Należy wymieszać zawartość, delikatnie potrząsając probówką; zawartości nie wolno mieszać w wstrząsarzu vortex.

Następnie inkubuj próbki kontroli pozytywnej, kontroli negatywnej oraz próbki badawczej w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po upływie pięciu minut przenieś wszystkie probówki reakcyjne do termocyklera. Dla PCR ustaw następujące warunki dla 40 cykli.

94°C przez 30 sekund. 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 40 sekund. Krok aktywacji nie jest wymagany przy stosowaniu polimerazy Jumpstart.

Po zakończeniu cykli PCR wyjmij próbki z termocyklera i umieść je na lodzie, aby schłodzić do temperatury od 4 do 8 °C. Próbki można następnie nałożyć na żel agarozowy do elektroforezy; bezpośrednio nanieś 8 µL z każdej reakcji PCR do oddzielnej studzienki. Przed naniesieniem próbek nie trzeba dodawać buforu do ładowania ani barwnika, ponieważ znajdują się one w probówkach z reakcją.

Zatrzymaj elektroforezę, gdy barwnik śledzący przemieści się o 2,5 do 3 cm. Reprezentatywne wyniki wykrywania mycoplasmas metodą PCR przedstawiono na tym obrazie ścieżki żelu agarozy. Ścieżka numer dwa to kontrola negatywna, która powinna wykazać prążek o długości około 481 par zasad.

Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 parach zasad jest dobrym wskaźnikiem tego, że zastosowany test TAC nie był wystarczająco czuły. Próbki dodatnie pod kątem obecności Mycoplasma wykażą prążki w zakresie 270 plus lub minus osiem par zasad, jak pokazano w ścieżkach od trzeciej do szóstej. Prążek będzie wyraźny w przypadku próbek silnie zanieczyszczonych i słabo widoczny w próbkach z niewielkim stopniem zanieczyszczenia.

Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną, aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. W przypadku próbek silnie zanieczyszczonych brak kontroli wewnętrznej jest zjawiskiem normalnym. Brak prążka zarówno w zakresie pozytywnym, jak i negatywnym, jak pokazano w ścieżce siódmej, jest dobrym wskaźnikiem tego, że próbki są inhibowane.

W przypadku inhibicji próbki inhibitory PCR można usunąć poprzez przeprowadzenie ekstrakcji DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat wykonywania wszystkich niezbędnych kroków opisanych w procedurze zestawu, a także interpretacji wyników i rozwiązywania problemów w razie potrzeby.