Name: Zoptymalizowane wykrywanie Mycoplasmy w oparciu o PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę PCR do wykrywania zakażeń Mycoplasma w hodowlach komórkowych. Film przedstawia przygotowanie próbek, amplifikację i analizę elektroforetyczną wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sfinansowano przez Sigma-Aldrich

1. Wykrywanie Mycoplasma
<ol>
	<li>Nadnadpłyny z hodowli komórkowych można badać bezpośrednio lub przygotować próbki do późniejszego użycia. Aby przygotować je do późniejszego użycia, należy umieścić 100 μl nadnadpłynu w sterylnej probówce do amplifikacji i inkubować w 95° C przez 5 minut. Po zakończeniu tej procedury próbki można przechowywać w temperaturze 2-8° C do jednego tygodnia. Bezpośrednio przed analizą próbki należy krótko odwirować (5 sekund), aby osadzić resztki komórkowe.</li>
	<li>W celu przygotowania próbek do PCR należy określić całkowitą objętość polimerazy Jumpstart Taq DNA/buforu do rehydratacji wymaganą do reakcji. Przygotujemy łącznie 5 reakcji. Pięć reakcji będzie wymagało 2,5 μl Taq i 114,5 μl buforu do rehydratacji. Zapewni to minimum jedną jednostkę Taq na reakcję oraz 22,5 μl buforu do rehydratacji na każdą reakcję z próbką i kontrolę negatywną, plus 24,5 μl buforu do rehydratacji dla kontroli pozytywnej. Do odpowiedniej objętości buforu do rehydratacji należy dodać 1 jednostkę polimerazy DNA na reakcję. Wartość ta zależy od stosowanej polimerazy Taq.</li>
	<li>Obliczoną objętość polimerazy Taq DNA należy przenieść do czystej probówki do mikrocentryfugi, a następnie dodać obliczoną objętość buforu do rehydratacji. Polimerazę DNA i bufor do rehydratacji należy wymieszać delikatnie, potrząsając probówką. Mieszaniny nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex.</li>
	<li>Do przygotowania kontroli negatywnej oraz próbek należy użyć przezroczystych probówek do reakcji dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej. Do każdej z probówek z kontrolą negatywną i próbkami należy przenieść 23 μl mieszaniny Jumpstart Taq DNA Polymerase/bufor do rehydratacji, przygotowanej w poprzednich krokach. Do kontroli negatywnej należy dodać 2 μl wody wolnej od DNA, a do każdej z probówek z próbkami dodać 2 μl próbki i opisać je. Zawartość należy wymieszać, potrząsając probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex.</li>
	<li>Do przygotowania kontroli pozytywnej należy użyć różowych probówek do reakcji dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej. Do probówek do reakcji należy dodać 25 μl mieszaniny Jumpstart Taq DNA polymerase/bufor do rehydratacji, przygotowanej w poprzednich krokach, i opisać je. Zawartość należy wymieszać, potrząsając probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu vortex. Kontrolę negatywną, kontrolę pozytywną i probówki z próbkami należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Aby przeprowadzić reakcję PCR, próbki należy umieścić w termocyklerze. Przy zastosowaniu JumpStart Taq etap aktywacji nie jest wymagany. Probówki do reakcji należy umieścić w termocyklerze. Cykle należy ustawić w następujący sposób: 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 40 sekund. Cykle te należy powtórzyć 40 razy.</li>
	<li>Po zakończeniu cykli PCR próbki należy schłodzić do 4-8°C, wyjmując je z termocyklera i umieszczając w lodzie. Po schłodzeniu próbek należy nanieść je na żel agarozowy do elektroforezy. Żel do nakładania oraz barwnik nie są konieczne, ponieważ znajdują się one już w probówkach do reakcji. Należy nanieść bezpośrednio 8 μl z każdego PCR do osobnej ścieżki. Elektroforezę należy przerwać po migracji na odległość 2,5 - 3,0 cm.</li>
</ol>
2. Reprezentatywne wyniki
Kontrola negatywna powinna wykazywać prążek o wielkości około 481 bp. Jest on widoczny w kolumnie kontroli negatywnej na żelu elektroforetycznym pokazanym na początku filmu. Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 bp jest dobrym wskaźnikiem tego, że aktywność polimerazy była niewystarczająca lub użyta Taq nie była wystarczająco czuła.
Próbki dodatnie pod kątem obecności Mycoplasma będą wykazywać prążki w zakresie 270 ± 8 bp. Prążek będzie wyraźny w przypadku próbek silnie zanieczyszczonych i słaby w przypadku próbek lekko zanieczyszczonych. Różnice w intensywności są widoczne w kolumnach próbek dodatnich na żelu elektroforetycznym pokazanym na początku filmu. Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną, aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. Brak kontroli wewnętrznej w próbkach silnie zanieczyszczonych jest zjawiskiem normalnym.
Jeśli w próbce nie pojawi się prążek w zakresie dodatnim ani w zakresie ujemnym, jest to istotny wskaźnik tego, że próbki są inhibowane. W przypadku wystąpienia inhibicji próbki, inhibitory PCR można usunąć, przeprowadzając ekstrakcję DNA.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelu DNA; drabinka 250 bp, kontrole, próbki z różnymi poziomami kontaminacji." src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Odpowiednie prążki amplikonów: Przedstawiono wyniki wykrywania mycoplasma za pomocą PCR. Ścieżka 2 to kontrola negatywna, która powinna wykazać prążek o wielkości około 481 bp. Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 bp jest dobrym wskaźnikiem tego, że zastosowana polimeraza Taq nie była wystarczająco czuła. Próbki dodatnie pod kątem obecności mycoplasma wykażą prążki w zakresie 270 + 8 bp, jak pokazano w ścieżkach 3–6. Prążek będzie intensywny dla próbek silnie skontaminowanych (ścieżka 6) i słabo widoczny dla próbek lekko skontaminowanych (ścieżka 4). Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną (481 bp), aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. Brak kontroli wewnętrznej w próbkach silnie skontaminowanych jest zjawiskiem normalnym.

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Sigma-Aldrich, która wyprodukowała odczynniki i narzędzia wykorzystane w niniejszym artykule.

Ze względu na ekstremalną czułość zestawu, przy prawidłowym wykonaniu powinien on dostarczyć precyzyjne wyniki wskazujące, czy próbka jest zanieczyszczona mycoplasmas. Zestaw został zoptymalizowany do pracy z JumpStart Taq DNA Polymerase. Podczas przygotowywania próbek można stosować inne polimerazy Taq, jednak pas kontroli wewnętrznej przy 481 bp powinien być widoczny, aby potwierdzić odpowiednią czułość zastosowanej alternatywnej polimerazy Taq. Pasma dodatnie mogą wykazywać różną intensywność w zależności od stopnia zanieczyszczenia. W przypadku próbek silnie zanieczyszczonych może wystąpić brak pasma kontroli wewnętrznej. Zachowanie ostrożności i stosowanie właściwej techniki podczas przygotowywania próbek w celu zapobiegania kontaminacji jest kluczowe dla prawidłowej detekcji przy użyciu zestawu LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

<table><tbody><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=MP0035%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-MP0035&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Zestaw do detekcji mycoplasmy metodą PCR LookOut&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MP0035</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D9307%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-D9307&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Polimeraza DNA Taq JumpStart&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9307</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=MP0030%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-MP0030&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">Zestaw do izolacji genomowego DNA z krwi GenElute&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MP0030</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T0447%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_mmc=JoVE-_-products-_-mycoplasma-_-T0447&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Probówki do amplifikacji Nunc&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0447</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana detekcja mycoplasma metodą pcr

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Utrzymanie linii komórkowych wolnych od zanieczyszczeń jest niezbędne w badaniach opartych na komórkach. Jednym z największych problemów w zakresie kontaminacji jest zakażenie mycoplasma. Chociaż mycoplasma zazwyczaj nie zabijają zakażonych komórek, są one trudne do wykrycia i mogą wywoływać szereg efektów w komórkach hodowlanych, w tym zmieniony metabolizm, spowolnioną proliferację oraz aberracje chromosomalne. Krótko mówiąc, kontaminacja mycoplasma obniża wartość tych linii komórkowych w dostarczaniu dokładnych danych dla badań nauk o życiu.
Źródła kontaminacji mycoplasmapodobnymi w laboratorium są bardzo trudne do całkowitego opanowania. Ponieważ niektóre gatunki mycoplasma występują na ludzkiej skórze, mogą one zostać wprowadzone do hodowli wskutek niewłaściwej techniki aseptycznej. Dodatkowo mogą one pochodzić z zanieczyszczonych dodatków, takich jak płodowa surowica bydlęca, a przede wszystkim z innych skontaminowanych kultur komórkowych. Gdy mycoplasma zanieczyści kulturę, może się ona szybko rozprzestrzenić, prowadząc do kontaminacji innych obszarów laboratorium. Kluczem do sukcesu jest ścisłe przestrzeganie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej, takich jak właściwa technika aseptyczna, a w celu skutecznego opanowania zanieczyszczeń wysoce zaleca się rutynowe testowanie pod kątem obecności mycoplasma.
Wykrywanie mycoplasma metodą PCR stało się bardzo popularnym sposobem rutynowego monitorowania linii komórkowych. Metody detekcji oparte na PCR są wysoce czułe i pozwalają na szybkie uzyskanie wyników, co w porównaniu do technik mikrobiologicznych umożliwia badaczom szybszą reakcję w celu wyizolowania i usunięcia kontaminacji po jej wykryciu. Zestaw LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit charakteryzuje się wysoką czułością, z granicą detekcji wynoszącą zaledwie 2 genomy na μl. Dzięki zastosowaniu wysoce specyficznej polimerazy JumpStart Taq DNA Polymerase oraz autorskiego projektu starterów znacznie zredukowano liczbę wyników fałszywie dodatnich. Praktyczny format 8 probówek, paski pokryte dNTP oraz dołączone startery pomagają zwiększyć przepustowość, aby sprostać potrzebom użytkowników posiadających duże kolekcje linii komórkowych.
Ze względu na ekstremalną czułość zestawu, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec przypadkowemu zanieczyszczeniu próbek i odczynników. Prezentowany przez nas protokół krok po kroku podkreśla środki ostrożności i praktyki niezbędne do wiarygodnego wykrywania mycoplasma. Przedstawiamy i omawiamy również typowe wyniki oraz ich interpretację. Naszym celem jest zapewnienie sukcesu badaczom korzystającym z zestawu LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Zestaw do wykrywania Mycoplasma metodą PCR LookOut wykorzystuje reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR), która jest uznawana za metodę z wyboru zapewniającą najwyższą czułość w wykrywaniu zanieczyszczeń Mycoplasma, Acholeplasma i Ureaplasma w hodowlach komórkowych oraz innych produktach biologicznych pochodzenia komórkowego.

Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Utrzymanie wolnych od zanieczyszczeń linii komórkowych jest niezbędne w badaniach opartych na komórkach. Jednym z najpoważniejszych problemów związanych z zanieczyszczeniami jest kontaminacja mycoplasmatami.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualne zaprezentowanie etapów wykorzystania zestawu do detekcji mycoplasma metodą PCR z linii Lookout, zoptymalizowanego pod kątem wykrywania kontaminacji mycoplasma. Cel ten osiąga się poprzez wstępne podgrzanie próbek do 95 °C w celu inaktywacji cząsteczek DNA, które mogłyby sprawić, że pożądana matryca będzie nieodpowiednia do reakcji PCR. Następnie przygotowuje się próbki do PCR, wykorzystując dostarczone probówki, które są wcześniej zakodowane nukleotydami, starterami oraz DNA kontroli wewnętrznej.Trzecim krokiem procedury jest cykliczność temperaturowa w warunkach starannie zoptymalizowanych tak, aby uzyskać najwyższą czułość i wyeliminować niespecyficzną amplifikację. Ostatecznie, poprzez ocenę za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, można uzyskać wyniki pozwalające stwierdzić, czy badane próbki są zanieczyszczone mycoplasmas. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że odczynniki są przygotowane wcześniej, a zastosowano wysokiej jakości probówki do PCR.Dzięki temu proces jest bardziej wygodny i wydajny. Inną zaletą tego zestawu jest to, że do wykrycia kontaminacji wymagane jest mniej niż dwa genomy mycoplasma na mikrolitr próbki. Podczas przeprowadzania procedury wykrywania mycoplasma należy unikać wszelkich możliwych zanieczyszczeń, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej w celu zminimalizowania kontaktu ze skórą, upewniając się, że wszystkie użyte odczynniki są wolne od zanieczyszczeń oraz przez cały czas zachowując właściwą technikę aseptyczną.Procedurę można przeprowadzić bezpośrednio na supernatantach z hodowli komórkowych lub przygotować próbki do wykorzystania w późniejszym terminie. Aby przygotować próbki do późniejszego użycia, należy przenieść 100 µL każdego supernatantu do sterylnej probówki do amplifikacji i inkubować w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Po inkubacji próbki mogą być przechowywane w temperaturze od 2 do 8 °C przez maksymalnie jeden tydzień.Bezpośrednio przed analizą próbek należy je krótko odwirować w celu osadzenia szczątków komórkowych. Aby przygotować próbki do PCR, należy w pierwszej kolejności określić całkowitą objętość buforu do rehydratacji polimerazy DNA wymaganą dla reakcji. Jedną jednostkę polimerazy DNA na reakcję należy dodać do odpowiedniej objętości buforu do rehydratacji, która będzie zależeć od użytej polimerazy; w niniejszym pokazie wykorzystana zostanie polimeraza TAC D 93 0 7 w pięciu reakcjach: trzech próbkach, jednej kontroli dodatniej oraz jednej kontroli ujemnej.Obliczoną objętość polimerazy DNA przenieś do czystej probówki do mikrowirówki, a następnie dodaj obliczoną objętość buforu do rehydratacji. Delikatnie wymieszaj polimerazę DNA z buforem do rehydratacji, lekko potrząsając probówką. Nie mieszaj tej mieszaniny w wirówce typu vortex.Do przygotowania kontroli negatywnej oraz próbek należy wykorzystać przezroczyste probówki reakcyjne dołączone do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej; do każdej z nich należy pipetować 23 µL wcześniej przygotowanego buforu do rehydratacji polimerazy DNA. Zawartość probówek kontroli negatywnej oraz próbek należy wymieszać.Następnie dodaj 2 µL wody wolnej od DNA do kontroli negatywnej oraz po 2 µL każdej próbki do odpowiednich probówek z próbkami. Wymieszaj zawartość, delikatnie stukując probówkami. Zawartości nie wolno mieszać w wstrząsaczu typu vortex.Aby przygotować kontrolę pozytywną, należy użyć różowych probówek reakcyjnych dołączonych do zestawu. Probówki te zawierają już nukleotydy, primery oraz DNA kontroli wewnętrznej; do probówki reakcyjnej należy dodać 25 µL mieszaniny buforu do rehydratacji polimerazy DNA. Należy wymieszać zawartość, delikatnie potrząsając probówką; zawartości nie wolno mieszać w wstrząsarzu vortex.Następnie inkubuj próbki kontroli pozytywnej, kontroli negatywnej oraz próbki badawczej w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po upływie pięciu minut przenieś wszystkie probówki reakcyjne do termocyklera. Dla PCR ustaw następujące warunki dla 40 cykli.94°C przez 30 sekund. 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 40 sekund. Krok aktywacji nie jest wymagany przy stosowaniu polimerazy Jumpstart.Po zakończeniu cykli PCR wyjmij próbki z termocyklera i umieść je na lodzie, aby schłodzić do temperatury od 4 do 8 °C. Próbki można następnie nałożyć na żel agarozowy do elektroforezy; bezpośrednio nanieś 8 µL z każdej reakcji PCR do oddzielnej studzienki. Przed naniesieniem próbek nie trzeba dodawać buforu do ładowania ani barwnika, ponieważ znajdują się one w probówkach z reakcją.Zatrzymaj elektroforezę, gdy barwnik śledzący przemieści się o 2,5 do 3 cm. Reprezentatywne wyniki wykrywania mycoplasmas metodą PCR przedstawiono na tym obrazie ścieżki żelu agarozy. Ścieżka numer dwa to kontrola negatywna, która powinna wykazać prążek o długości około 481 par zasad.Brak prążka kontroli negatywnej przy 481 parach zasad jest dobrym wskaźnikiem tego, że zastosowany test TAC nie był wystarczająco czuły. Próbki dodatnie pod kątem obecności Mycoplasma wykażą prążki w zakresie 270 plus lub minus osiem par zasad, jak pokazano w ścieżkach od trzeciej do szóstej. Prążek będzie wyraźny w przypadku próbek silnie zanieczyszczonych i słabo widoczny w próbkach z niewielkim stopniem zanieczyszczenia.Wszystkie próbki zawierają wewnętrzną kontrolę negatywną, aby wykazać, że reakcja PCR przebiegła zgodnie z oczekiwaniami. W przypadku próbek silnie zanieczyszczonych brak kontroli wewnętrznej jest zjawiskiem normalnym. Brak prążka zarówno w zakresie pozytywnym, jak i negatywnym, jak pokazano w ścieżce siódmej, jest dobrym wskaźnikiem tego, że próbki są inhibowane.W przypadku inhibicji próbki inhibitory PCR można usunąć poprzez przeprowadzenie ekstrakcji DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat wykonywania wszystkich niezbędnych kroków opisanych w procedurze zestawu, a także interpretacji wyników i rozwiązywania problemów w razie potrzeby.

optimized-pcr-based-detection-of-mycoplasma

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zoptymalizowane wykrywanie Mycoplasmy w oparciu o PCR

Opracowanie prostego, jednodniowego schematu przepływu pracy w diagnostyce patogenów bakteryjnych umożliwia szybkie rozpoznanie zakażeń krwi. Uwzględnienie ośmiu istotnych klinicznie celów bakteryjnych oraz ich profili oporności na antybiotyki dostarcza lekarzowi wstępnych informacji tego samego dnia, co może prowadzić do zastosowania bardziej odpowiedniej terapii.

Jednodniowy schemat przepływu pracy dla wykrywania patogenów bakteryjnych i badania oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe z posiewów krwi

Opisujemy metodę multipleksową do wykrywania mikroorganizmów w próbce z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami. Amplikony wszystkich organizmów w próbce są hybrydyzowane z panelem kulek sprzężonych z sondami. Do analizy typu każdej kulki oraz sygnału hybrydyzacji wykorzystywany jest instrument Luminex lub Bio-Plex.

Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Test qPCR został opracowany do wykrywania Escherichia coli O157:H7 z unikalnym markerem genetycznym, Z3276. qPCR połączono z leczeniem monoazydkiem propidyny (PMA) w celu wykrywania żywych komórek. Protokół ten został zmodyfikowany i dostosowany do formatu płytki 96-dołkowej w celu łatwej i spójnej obsługi wielu...

Wykrywanie żywych komórek Escherichia coli O157:H7 metodą PMA-qPCR

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Opracowaliśmy metodę wykrywania zoospor Phytophthora capsici w źródłach wody za pomocą metody ekstrakcji DNA z bibuły filtracyjnej w połączeniu z testem amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), który może być analizowany w terenie lub w laboratorium.

Wykrywanie Phytophthora capsici w wodzie do nawadniania za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Niniejszy protokół opisuje w pełni zintegrowaną metodę LAMP opartą na chipie mikroprzepływowym, umożliwiającą w ciągu jednej godziny wykrycie w punkcie opieki (point-of-care) 15 patogenów wywołujących infekcje dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii.

Szybka detekcja w miejscu opieki (point-of-care) patogenów wywołujących zakażenia dolnych dróg oddechowych u pacjentów na oddziałach intensywnej terapii

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Poznaj zoptymalizowaną metodę PCR do wykrywania zakażeń Mycoplasma w hodowlach komórkowych. Film przedstawia przygotowanie próbek, amplifikację i analizę elektroforetyczną wyników.

Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Przeglądaj więcej filmów