Name: Biochemiczna rekonstytucja receptorów steroidowych • Hsp90 kompleksów białkowych i reaktywacja wiązania ligandów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji kompleksów białkowych GR•Hsp90 w celu reaktywacji wiązania ligandów receptorów steroidowych. Technika ta umożliwia badanie wymagań kofaktorowych i wpływu związków egzogennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health GM086822, nagrody Hope Heart Institute Basic Sciences oraz programu College Science Research Program fundacji M. J. Murdock Charitable Trust. Wybrane odczynniki do elektroforezy oraz oprogramowanie do analizy obrazów zostały uprzejmie udostępnione przez firmę Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

Wybrane odczynniki do elektroforezy oraz oprogramowanie do analizy obrazów zostały dostarczone przez firmę Bio-Rad.

Opisany powyżej test można dostosować do badania wielu warunków wpływających na działanie maszynerii chaperonowej opartej na hsp90/hsp70, a także na wiązanie steroidów przez GR. Jest on modyfikacją wcześniej opisanych metod 4,8,9,17 i został zaprojektowany tak, aby wykorzystać ostatnie postępy w technologii elektroforezy oraz być dostępnym dla szerszego grona badaczy. Do mieszaniny rekonstrukcji heterokompleksu GR•hsp90, opisanej w kroku 4 protokołu, można dodać dodatkowe kofaktory lub białka zainteresowania, ...

<table><tbody><tr><td>Komórki owadzie Sf9</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>do ekspresji rekombinowanego mysiego GR z wykorzystaniem bakulowirusów</td></tr><tr><td>Komórki L929</td><td>ATCC</td><td>CRL-2173</td><td>do przygotowania cytozolu z endogennym mysim GR (alternatywa dla ekspresji bakulowirusowej)</td></tr><tr><td>Komórki hybridoma FiGR</td><td>ATCC</td><td>CRL-2173</td><td>do przygotowania wodobrzusza zawierającego monoklonalne przeciwciało anty-GR (alternatywa dla oczyszczonego przeciwciała BuGR2)</td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz Complete-Mini, bez EDTA</td><td>Roche Group</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>protein A-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3391</td><td></td></tr><tr><td>Lizat retikulocytów królika</td><td>Green Hectares (Oregon, WI)</td><td></td><td>bogate źródło endogennego mechanizmu chaperonowego hsp90/hsp70</td></tr><tr><td>Kreatynofosfokinaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td>do systemu regeneracji ATP</td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td>do systemu regeneracji ATP</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-GR (BuGR2)</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>MA1-510</td><td>stosowane do immunoadsorpcji GR oraz jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-hsp90 (AC88)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-SPA-830</td><td>stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-hsp70 (N27F3-4)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-SPA-820</td><td>stosowane jako przeciwciało pierwszorzędowe w western blottingu</td></tr><tr><td>IgG z surowicy mysiej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>038K7690</td><td>stosowane jako przeciwciało nieimmunne do ujemnej kontroli immunoadsorpcji</td></tr><tr><td>Koniugat IgG przeciwko mysi z peroksydazą</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td>stosowane jako przeciwciało drugorzędowe w western blottingu</td></tr><tr><td>Mikrofluidyczny system elektroforezy Experion</td><td>Bio-Rad</td><td>7007001</td><td>alternatywa dla konwencjonalnego SDS-PAGE</td></tr><tr><td>[1,2,4,6,7-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H] deksametazon</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NET1192001MC</td><td>przestrzegać środków ostrożności</td></tr></tbody></table>

biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 jest niezbędnym i wysoce rozpowszechnionym białkiem opiekuńczym (chaperoną), które reguluje ponad 150 białek sygnałowych eukariotów, w tym czynniki transkrypcyjne (np. receptory jądrowe, p53) oraz kinazy białkowe (np. kinazy Src, Raf, Akt) zaangażowane w cykl komórkowy, tumorigenezę, apoptozę oraz liczne eukariotyczne szlaki sygnałowe 1,2. Spośród wielu tych białek „klientów” hsp90, najlepiej scharakteryzowany jest proces składania kompleksów receptor steroidowy•hsp90 (Rysunek 1). Przedstawiamy tutaj adaptacyjny test immunoprecypitacji receptora glikokortykoidowego (GR) oraz metodę rekonstytucji GR•hsp90 in vitro, które mogą być łatwo wykorzystane do badania aktywności funkcjonalnej eukariotycznego hsp90, wiązania ligandu receptora steroidowego zapośredniczonego przez hsp90 oraz wymagań co do kofaktorów białek opiekuńczych. Przykładowo, test ten może być użyty do weryfikacji wymagań kofaktorowych hsp90 oraz wpływu dodania egzogennych związków do procesu rekonstytucji.
GR okazał się szczególnie użytecznym systemem do badania hsp90, ponieważ receptor musi być związany z hsp90, aby posiadać otwartą szczelinę wiążącą ligand, która jest dostępna dla steroidów 3. Endogenny, niezwiązany z ligandem GR występuje w cytoplazmie komórek ssaków w formie niekowalencyjnie związanej z hsp90. W endogennym heterokompleksie GR•hsp90 szczelina wiążąca ligand GR jest otwarta i zdolna do wiązania steroidu. Jeśli hsp90 odłączy się od GR lub jeśli jego funkcja zostanie zahamowana, receptor nie jest w stanie wiązać steroidu i wymaga rekonstrukcji heterokompleksu GR•hsp90 przed przywróceniem aktywności wiązania steroidów 4. GR można immunoprecypitować z cytosolu komórkowego przy użyciu przeciwciała monoklonalnego, a białka takie jak hsp90 tworzące kompleks z GR można analizować za pomocą western blotu. Aktywność wiązania steroidów immunoprecypitowanego GR można określić poprzez inkubację osadu immunologicznego z [3H]steroidem.
Poprzednie eksperymenty wykazały, że otwarcie szczeliny wiążącej ligand GR za pośrednictwem hsp90 wymaga hsp70, drugiego białka opiekuńczego, które jest również niezbędne dla żywotności komórek eukariotycznych. Aktywność biochemiczna hsp90 i hsp70 jest katalizowana przez białka kopekuńcze Hop, hsp40 oraz p23 5. Wielobiałkowy kompleks opiekuńczy zawierający hsp90, hsp70, Hop i hsp40 występuje endogennie w cytoplazmie komórek eukariotycznych, a lizat retikulocytów stanowi bogate w białka opiekuńcze źródło białek 6.
W przedstawionej metodzie GR jest immunoadsorbowany z cytozolu komórkowego, a następnie pozbawiany endogennego mechanizmu chaperonowego hsp90/hsp70 przy użyciu łagodnych warunków zasoloneń. Tak oczyszczony GR jest następnie inkubowany z lizatem retikulocytów, ATP oraz K+, co prowadzi do rekonstytucji heterokompleksu GR•hsp90 i reaktywacji aktywności wiązania steroidów 7. Metoda ta może być wykorzystana do badania wpływu różnych kofaktorów chaperonowych, nowych białek oraz eksperymentalnych inhibitorów hsp90 lub GR w celu określenia ich funkcjonalnego znaczenia dla zależnego od hsp90 wiązania steroidów 8-11.

Opisano metodę in vitro przygotowywania funkcjonalnych kompleksów białkowych receptora glikokortykoidowego (GR)•hsp90 z oczyszczonych białek oraz lizatów komórkowych. Metoda wykorzystuje immunoadsorpcję rekombinowanego GR, po której następuje usuwanie soli (salt-stripping) i rekonstytucja kompleksu białkowego. Omówiono znaczenie kofaktorów i warunków buforowych, a także potencjalne zastosowania tej metody.

Biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•Hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

Hsp90 jest niezbędnym i występującym w dużych ilościach białkiem opiekuńczym (chaperoną), o którym wykazano, że reguluje ponad 150 białek sygnałowych organizmów eukariotycznych, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest biochemiczna rekonstytucja kompleksu białkowego receptora steroidowego HSB 90 oraz reaktywacja aktywności wiązania ligandu przez receptor steroidowy, co może być wykorzystane do badania wymagań co do kofaktorów HSB 90 oraz wpływu dodawania egzogennych związków na proces rekonstytucji. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie cytozolu komórkowego zawierającego funkcjonalne receptory glikokortykoidów. Następnie GR z cytozolu komórkowego jest poddawany immunoabsorpcji oraz usuwaniu czynników endogennych.HSP 90 ulega dysocjacji. Następnie heterokompleks GR HSP 90 jest rekonstruowany z wykorzystaniem egzogennego źródła HSP 90 oraz innych białek opiekuńczych i kofaktorów. Na koniec analizuje się zrekonstruowane kompleksy białkowe oraz aktywność wiązania ligandu; w szczególności wykorzystuje się takie metody jak elektroforeza SDS-PAGE, western blotting oraz testy wiązania ligandu z użyciem izotopów promieniotwórczych, aby wykazać tworzenie heterokompleksu GR HSP 90 oraz aktywność wiązania steroidów.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie molekularnych chaperonów HSP 90, takie jak to, jakie chaperony kofaktorowe i chaperony COS są wymagane do usprawnienia aktywności funkcjonalnej HSP 90. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w zwijanie białek, można ją zastosować również w innych systemach, takich jak opracowywanie związków wiodących zależnych od HSP 90 oraz analiza wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych wymagających HSP 90. Procedurę zaprezentują Hannah Franklin i Nathan for AWA, dwoje studentów niedawno absolwentów mojego laboratorium. Aby wyizolować funkcjonalny receptor glikokortykoidowy lub GR, należy hodować komórki fibroblastów mysich L 9 29 lub komórki SF nine, które zostały zainfekowane rekombinowanym wirusem baculovirus GR i znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 5 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Otrzymany pellet powinien mieć objętość od jednego do pięciu mililitrów. Przemyj pellet komórkowy trzykrotnie 15 mililitrami roztworu Hank's buffered saline solution. Przygotuj 1,5 objętości buforu do homogenizacji zawierającego bufor HEM, jeden milimolar phenyl methyl syl fluoride lub PMSF oraz trzy kompletne tabletki mini protease inhibitor, rozkruszone za pomocą 50 uderzeń tłuczka.Komórki rozbito za pomocą homogenizatora, wykonując ten krok na lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Homogenizat odwirowano w ultrawiroworce przy 100 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadnadkład zawierający cytosol podzielono na aliquoty po 500 µL do probówek do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml i przechowywano w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Aby przygotować mieszaninę zawierającą monoklonalne przeciwciało IgG skierowane przeciwko receptorowi specyficznemu GR, połączyć 100 µL rozmrożonego cytosolu zawierającego GR, 200 µL buforu TEGM, 100 µL 20% zawiesiny białkowej asero lub PAS oraz 5 µg monoklonalnego przeciwciała IgG anty-G, takiego jak bugger dwa. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar kulek PAS.Użyj przyciętego końcówki pipety P 200, aby przenieść PAS z 20% zawiesiny do probówek z próbkami. Umieść próbki na pionowym wirującym kole i inkubuj przez minimum dwie godziny przy stałej rotacji. Następnie usuń niezwiązane białka z osadu przeciwciał PAS, wirując próbki w wirówce chłodzącej przez jedną minutę.Przy 10 000 Gs przemyj osad dwukrotnie, dodając jeden mililitr buforu TEGM, mieszając na wortexie, a następnie wirując. Usuń końcowy płukanie za pomocą zaciśniętej końcówki pipety P 200, aby odseparować endogenne HSB 90 od immuno-osadu GR, a następnie dodaj do przeciwciała 355 mikrolitrów buforu TEG i 45 mikrolitrów pięciomolarnego chlorku sodu. Osad PAS przygotowano wcześniej.Próbki należy umieścić na pionowym kole obrotowym i inkubować przez półtorej godziny przy stałym obracaniu. Niezwiązane białka należy usunąć z osadu immunologicznego poprzez wirowanie przez jedną minutę przy 10 000 Gs. Osady należy przemyć raz jednym mililitrem buforu TEG i raz jednym mililitrem buforu HEPES 10 mM o pH 7,4. Używając ściętej końcówki pipety P 200, należy usunąć płuczynkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.Aby zrekonstytuować hetero kompleks GR HSB 90, dodaj do osadu mieszaninę zawierającą 50 µL źródła chaperonów molekularnych, np. lizatu retikulocytów królika, oraz 5 µL systemu generującego ATP. Ten kolejny krok jest kluczowy dla zapewnienia odpowiedniego wymieszania osadu z roztworem do rekonstytucji. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez dokładnie 20 minut.Przez jedną lub dwie minuty lekko potrząsaj probówkami, aby delikatnie rozbić osad i wymieszać roztwór do rekonstytucji. Dodaj 1 mL buforu TEGM, wymieszaj w wortexie, a następnie wiruj przy 10 000 G przez jedną minutę. Usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.Powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby zidentyfikować białka w zrekonstytuowanym osadzie. Przygotuj próbki do elektroforezy, dodając 50 µL buforu do próbek SDS-PAGE zawierającego β-merkaptoetanol. Wymieszaj próbki, a następnie inkubuj przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia lub w elektronicznym bloku grzewczym ustawionym na 100 °C.Odwiruj próbki przy 10 000 G przez jedną minutę. Nadlodów z tych próbek wykorzystaj do elektroforezy SDS-PAGE lub elektroforezy mikroprzepływowej z późniejszym western blotem. Użycie końcówki P 200 z obciętym końcem do nakładania nadlodów ograniczy przypadkowe zassanie osadu.Kolejnym krokiem jest analiza aktywności wiązania steroidów kompleksu białkowego GR HSP 90. Wykorzystując steroid znakowany trytem, należy rozpocząć od dodania do zrekonstytuowanego osadu immunologicznego 47,5 µL buforu HEM oraz 2,5 µL 2 µM znakowanej trytem dekzametazonu.Ostrożnie wymieszaj osad, starając się zminimalizować ilość próbki osadzającej się na ściance probówki do mikrowirówki. Inkubuj próbkę przez noc w lodzie, nie poruszając nią. Dodaj 1 mL buforu TEGM, delikatnie wymieszaj i odwirowuj z prędkością 10 000 g przez jedną minutę.Uważnie odlej supernatant. Zawiera on niezwiązany steryd tritiowany. Powtórz proces tak, aby łącznie przeprowadzić trzy pełne przemycia buforem TEGM. Po zakończeniu ostatniego przemycia całkowicie usuń supernatant.Używając zaciśniętego końcówki do pipety P 200. Zawiesić przemyte pellety immunologiczne w 200 µL buforu TEGM i przenieść do 10 ml probówek scyntylacyjnych.Do probówek dodać 4,8 mililitrów koktajlu scyntylacyjnego i wymieszać w wortexie. Następnie przeprowadzić spektrometrię scyntylacyjną cieczy; reprezentatywne dane z elektroforezy SDS-PAGE i western blot przedstawiono tutaj na tym żelu barwionym kumasi. Endogenny heterokompleks GR HSB 90 został immunoabsorbowany z cytozolu komórkowego przy użyciu przeciwciał anty-GR, a zwizualizowano białka indywidualne, które zostały współabsorbowane z GR.Poniżej przedstawiono dane z mikroprzepływowej elektroforezy Experian reprezentujące zrekonstytuowane heterokompleksy GR HSP 90. Specyficzność immunoabsorpcji GR potwierdzono poprzez zastąpienie przeciwciała anty-GR absorbującego w immunoabsorpcji przeciwciałem nieimmunologicznym, nawet przy zastosowaniu nadmiarowych ilości. Nie wybiórczo wytrącono GR ani białek opiekuńczych.Podobnie, dysocjację HSP 90 oraz innych białek opiekuńczych z GR po odkrystalizowaniu solą można potwierdzić za pomocą analizy western blot granulowanych pelletów immunologicznych po strippingu i rekonstytucji. Ciężki łańcuch przeciwciała użytego do immunoadsorpcji jest wykrywalny zarówno przez barwienie kumasi, jak i western blotting, co potwierdza, że w każdej ścieżce wizualizowane są pellety immunologiczne o tej samej wielkości. Przedstawiono tutaj reprezentatywne dane dotyczące aktywności wiązania steroidów dla immunoadsorbowanego GR z zastosowaniem lizatu retikulocytów lub oczyszczonych białek.Aktywność wiązania steroidów zrekonstytuowanego heterokompleksu GR HSP90 zazwyczaj powraca do poziomu od 75 do 100% aktywności wiązania endogennego kompleksu GR HSP90. Podobnie jak w przypadku danych z elektroforezy, w ramach kontroli negatywnej oraz w celu pomiaru nieswoistego wiązania steroidów znakowanych trytem, zamiast przeciwciał anty-GR można zastosować przeciwciała nieimmunne. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o wpływ powymiarowych modyfikacji HSP90 na rekonstytucję heterokompleksu i wiązanie steroidów. Testy rekonstytucji, takie jak opisane w niniejszym materiale, pozwoliły badaczom zgłębić funkcjonalne znaczenie opartego na HSP90 i HSP70 mechanizmu chaperonowego MultiPro oraz jego etapowego montażu, wykorzystując receptor glikokortykoidowy jako modelowe białko klient HSP90.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć sposób przygotowania funkcjonalnych kompleksów białkowych receptora glukokortykoidów z HSP 90 z oczyszczonych białek w lizatach komórkowych. Zastosowane kroki obejmują przygotowanie lizatu komórkowego zawierającego GR, immunoprecypitację receptora, usuwanie endogennych białek za pomocą soli oraz rekonstytucję heterokompleksu przy użyciu egzogennego HSP 90, kofaktorów HSP 70 oraz koszapieronów.

biochemical-reconstitution-steroid-receptorhsp90-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Biochemiczne odtworzenie receptora steroidowego• Kompleksów białka Hsp90 i reaktywacja wiązania ligandu

W tym filmie opisujemy test konkurencyjnego wiązania oparty na cytometrii przepływowej, który wykrywa interakcje między receptorem CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) a jego fluorescencyjnie znakowanym naturalnym ligandem CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), w obecności małej cząsteczki ukierunkowanej na CXCR4. Inkubacja komórek wykazujących ekspresję CXCR4 o niższych stężeniach małych cząsteczek umożliwia wiązanie CXCR4-CXCL12 do pewnego stopnia, które stopniowo zmniejsza się wraz ze stopniowym...

Konkurencyjny test wiązania w celu identyfikacji związków zakłócających interakcje receptor-ligand

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Ketokonazol wiąże się z aktywacją receptora Pregnane X (PXR) i antagonizuje ją. Wysokoprzepustowe badania przesiewowe mutantów PXR u drożdży definiują unikalny region wiązania ketokonazolu. Ta metoda genetyczna oparta na drożdżach odkrywa nowe interakcje receptorów jądrowych z ligandami, które wiążą się z miejscami wiązania powierzchniowego.

Odwrócony dwuhybrydowy system drożdży w celu identyfikacji reszt receptorów jądrowych ssaków, które oddziałują z ligandami i / lub antagonistami

Tutaj opisujemy metody, które powszechnie stosujemy w laboratorium, aby określić, jak natura interakcji między receptorem limfocytów T a antygenami nowotworowymi, prezentowana przez ludzkie antygeny leukocytów, reguluje funkcjonalność komórek T; metody te obejmują produkcję białek, krystalografię rentgenowską, biofizykę i eksperymenty z funkcjonalnymi komórkami T.

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej, biofizyki i testów funkcjonalnych do określenia mechanizmów rządzących rozpoznawaniem antygenów nowotworowych przez receptory komórek T

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Przedstawiono procedurę ponownego fałdowania domeny wiążącej ligand peryplazmatyczny dCACHE chemoreceptora Campylobacter jejuni Tlp3 z ciał inkluzyjnych i oczyszczania w celu uzyskania miligramowych ilości białka.

Metoda skutecznego ponownego fałdowania i oczyszczania domeny wiążącej ligand chemoreceptora

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Ten protokół przedstawia technikę badania interakcji białko-białko za pomocą koralików donorowych połączonych z glutationem z ko-chaperonami z motywem TPR i koralikami akceptorowymi sprzężonymi z peptydem pochodzącym z Hsp90. Wykorzystaliśmy tę technikę do badań przesiewowych małych cząsteczek w celu zakłócenia interakcji Hsp90-FKBP51 lub Hsp90-FKBP52 i zidentyfikowaliśmy silne i selektywne inhibitory interakcji Hsp90-FKBP51.

Badania interakcji chaperon-cochaperone przy użyciu jednorodnego testu na bazie kulek

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Poznaj metodę rekonstytucji kompleksów białkowych GR•Hsp90 w celu reaktywacji wiązania ligandów receptorów steroidowych. Technika ta umożliwia badanie wymagań kofaktorowych i wpływu związków egzogennych.

Biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•Hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

Przeglądaj więcej filmów