Biochemiczna rekonstrukcja kompleksów białkowych receptor steroidowy•Hsp90 oraz reaktywacja wiązania ligandu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest biochemiczna rekonstytucja kompleksu białkowego receptora steroidowego HSB 90 oraz reaktywacja aktywności wiązania ligandu przez receptor steroidowy, co może być wykorzystane do badania wymagań co do kofaktorów HSB 90 oraz wpływu dodawania egzogennych związków na proces rekonstytucji. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie cytozolu komórkowego zawierającego funkcjonalne receptory glikokortykoidów. Następnie GR z cytozolu komórkowego jest poddawany immunoabsorpcji oraz usuwaniu czynników endogennych.

HSP 90 ulega dysocjacji. Następnie heterokompleks GR HSP 90 jest rekonstruowany z wykorzystaniem egzogennego źródła HSP 90 oraz innych białek opiekuńczych i kofaktorów. Na koniec analizuje się zrekonstruowane kompleksy białkowe oraz aktywność wiązania ligandu; w szczególności wykorzystuje się takie metody jak elektroforeza SDS-PAGE, western blotting oraz testy wiązania ligandu z użyciem izotopów promieniotwórczych, aby wykazać tworzenie heterokompleksu GR HSP 90 oraz aktywność wiązania steroidów.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie molekularnych chaperonów HSP 90, takie jak to, jakie chaperony kofaktorowe i chaperony COS są wymagane do usprawnienia aktywności funkcjonalnej HSP 90. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w zwijanie białek, można ją zastosować również w innych systemach, takich jak opracowywanie związków wiodących zależnych od HSP 90 oraz analiza wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych wymagających HSP 90. Procedurę zaprezentują Hannah Franklin i Nathan for AWA, dwoje studentów niedawno absolwentów mojego laboratorium. Aby wyizolować funkcjonalny receptor glikokortykoidowy lub GR, należy hodować komórki fibroblastów mysich L 9 29 lub komórki SF nine, które zostały zainfekowane rekombinowanym wirusem baculovirus GR i znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 5 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Otrzymany pellet powinien mieć objętość od jednego do pięciu mililitrów. Przemyj pellet komórkowy trzykrotnie 15 mililitrami roztworu Hank's buffered saline solution. Przygotuj 1,5 objętości buforu do homogenizacji zawierającego bufor HEM, jeden milimolar phenyl methyl syl fluoride lub PMSF oraz trzy kompletne tabletki mini protease inhibitor, rozkruszone za pomocą 50 uderzeń tłuczka.

Komórki rozbito za pomocą homogenizatora, wykonując ten krok na lodzie, aby zapobiec degradacji białek. Homogenizat odwirowano w ultrawiroworce przy 100 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadnadkład zawierający cytosol podzielono na aliquoty po 500 µL do probówek do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml i przechowywano w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Aby przygotować mieszaninę zawierającą monoklonalne przeciwciało IgG skierowane przeciwko receptorowi specyficznemu GR, połączyć 100 µL rozmrożonego cytosolu zawierającego GR, 200 µL buforu TEGM, 100 µL 20% zawiesiny białkowej asero lub PAS oraz 5 µg monoklonalnego przeciwciała IgG anty-G, takiego jak bugger dwa. Ze względu na stosunkowo duży rozmiar kulek PAS.

Użyj przyciętego końcówki pipety P 200, aby przenieść PAS z 20% zawiesiny do probówek z próbkami. Umieść próbki na pionowym wirującym kole i inkubuj przez minimum dwie godziny przy stałej rotacji. Następnie usuń niezwiązane białka z osadu przeciwciał PAS, wirując próbki w wirówce chłodzącej przez jedną minutę.

Przy 10 000 Gs przemyj osad dwukrotnie, dodając jeden mililitr buforu TEGM, mieszając na wortexie, a następnie wirując. Usuń końcowy płukanie za pomocą zaciśniętej końcówki pipety P 200, aby odseparować endogenne HSB 90 od immuno-osadu GR, a następnie dodaj do przeciwciała 355 mikrolitrów buforu TEG i 45 mikrolitrów pięciomolarnego chlorku sodu. Osad PAS przygotowano wcześniej.

Próbki należy umieścić na pionowym kole obrotowym i inkubować przez półtorej godziny przy stałym obracaniu. Niezwiązane białka należy usunąć z osadu immunologicznego poprzez wirowanie przez jedną minutę przy 10 000 Gs. Osady należy przemyć raz jednym mililitrem buforu TEG i raz jednym mililitrem buforu HEPES 10 mM o pH 7,4. Używając ściętej końcówki pipety P 200, należy usunąć płuczynkę, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Aby zrekonstytuować hetero kompleks GR HSB 90, dodaj do osadu mieszaninę zawierającą 50 µL źródła chaperonów molekularnych, np. lizatu retikulocytów królika, oraz 5 µL systemu generującego ATP. Ten kolejny krok jest kluczowy dla zapewnienia odpowiedniego wymieszania osadu z roztworem do rekonstytucji. Inkubuj próbki w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez dokładnie 20 minut.

Przez jedną lub dwie minuty lekko potrząsaj probówkami, aby delikatnie rozbić osad i wymieszać roztwór do rekonstytucji. Dodaj 1 mL buforu TEGM, wymieszaj w wortexie, a następnie wiruj przy 10 000 G przez jedną minutę. Usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby zidentyfikować białka w zrekonstytuowanym osadzie. Przygotuj próbki do elektroforezy, dodając 50 µL buforu do próbek SDS-PAGE zawierającego β-merkaptoetanol. Wymieszaj próbki, a następnie inkubuj przez pięć minut w łaźni wodnej w temperaturze wrzenia lub w elektronicznym bloku grzewczym ustawionym na 100 °C.

Odwiruj próbki przy 10 000 G przez jedną minutę. Nadlodów z tych próbek wykorzystaj do elektroforezy SDS-PAGE lub elektroforezy mikroprzepływowej z późniejszym western blotem. Użycie końcówki P 200 z obciętym końcem do nakładania nadlodów ograniczy przypadkowe zassanie osadu.

Kolejnym krokiem jest analiza aktywności wiązania steroidów kompleksu białkowego GR HSP 90. Wykorzystując steroid znakowany trytem, należy rozpocząć od dodania do zrekonstytuowanego osadu immunologicznego 47,5 µL buforu HEM oraz 2,5 µL 2 µM znakowanej trytem dekzametazonu.

Ostrożnie wymieszaj osad, starając się zminimalizować ilość próbki osadzającej się na ściance probówki do mikrowirówki. Inkubuj próbkę przez noc w lodzie, nie poruszając nią. Dodaj 1 mL buforu TEGM, delikatnie wymieszaj i odwirowuj z prędkością 10 000 g przez jedną minutę.

Uważnie odlej supernatant. Zawiera on niezwiązany steryd tritiowany. Powtórz proces tak, aby łącznie przeprowadzić trzy pełne przemycia buforem TEGM. Po zakończeniu ostatniego przemycia całkowicie usuń supernatant.

Używając zaciśniętego końcówki do pipety P 200. Zawiesić przemyte pellety immunologiczne w 200 µL buforu TEGM i przenieść do 10 ml probówek scyntylacyjnych.

Do probówek dodać 4,8 mililitrów koktajlu scyntylacyjnego i wymieszać w wortexie. Następnie przeprowadzić spektrometrię scyntylacyjną cieczy; reprezentatywne dane z elektroforezy SDS-PAGE i western blot przedstawiono tutaj na tym żelu barwionym kumasi. Endogenny heterokompleks GR HSB 90 został immunoabsorbowany z cytozolu komórkowego przy użyciu przeciwciał anty-GR, a zwizualizowano białka indywidualne, które zostały współabsorbowane z GR.

Poniżej przedstawiono dane z mikroprzepływowej elektroforezy Experian reprezentujące zrekonstytuowane heterokompleksy GR HSP 90. Specyficzność immunoabsorpcji GR potwierdzono poprzez zastąpienie przeciwciała anty-GR absorbującego w immunoabsorpcji przeciwciałem nieimmunologicznym, nawet przy zastosowaniu nadmiarowych ilości. Nie wybiórczo wytrącono GR ani białek opiekuńczych.

Podobnie, dysocjację HSP 90 oraz innych białek opiekuńczych z GR po odkrystalizowaniu solą można potwierdzić za pomocą analizy western blot granulowanych pelletów immunologicznych po strippingu i rekonstytucji. Ciężki łańcuch przeciwciała użytego do immunoadsorpcji jest wykrywalny zarówno przez barwienie kumasi, jak i western blotting, co potwierdza, że w każdej ścieżce wizualizowane są pellety immunologiczne o tej samej wielkości. Przedstawiono tutaj reprezentatywne dane dotyczące aktywności wiązania steroidów dla immunoadsorbowanego GR z zastosowaniem lizatu retikulocytów lub oczyszczonych białek.

Aktywność wiązania steroidów zrekonstytuowanego heterokompleksu GR HSP90 zazwyczaj powraca do poziomu od 75 do 100% aktywności wiązania endogennego kompleksu GR HSP90. Podobnie jak w przypadku danych z elektroforezy, w ramach kontroli negatywnej oraz w celu pomiaru nieswoistego wiązania steroidów znakowanych trytem, zamiast przeciwciał anty-GR można zastosować przeciwciała nieimmunne. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład o wpływ powymiarowych modyfikacji HSP90 na rekonstytucję heterokompleksu i wiązanie steroidów. Testy rekonstytucji, takie jak opisane w niniejszym materiale, pozwoliły badaczom zgłębić funkcjonalne znaczenie opartego na HSP90 i HSP70 mechanizmu chaperonowego MultiPro oraz jego etapowego montażu, wykorzystując receptor glikokortykoidowy jako modelowe białko klient HSP90.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć sposób przygotowania funkcjonalnych kompleksów białkowych receptora glukokortykoidów z HSP 90 z oczyszczonych białek w lizatach komórkowych. Zastosowane kroki obejmują przygotowanie lizatu komórkowego zawierającego GR, immunoprecypitację receptora, usuwanie endogennych białek za pomocą soli oraz rekonstytucję heterokompleksu przy użyciu egzogennego HSP 90, kofaktorów HSP 70 oraz koszapieronów.