Zautomatyzowany wybór kolumny chromatograficznej do chromatografii oddziaływań hydrofobowych do stosowania w oczyszczaniu białek

Ogólnym celem tej procedury jest wybór optymalnej kolumny do chromatografii cieczowej HI przy użyciu zautomatyzowanej metody rozpoznania do oczyszczania białka rekombinowanego za pomocą systemu przepływowej średniociśnieniowej chromatografii cieczowej BioRad DUO. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie niezbędnych i lizatów bakteryjnych zawierających rekombinowane białko będące przedmiotem zainteresowania. Następnie system chromatografii przepływowej duo jest fizycznie konfigurowany, podłączany do instalacji wodno-kanalizacyjnej i przygotowywany do protokołu rozpoznania.

Następnie próbki są ładowane i uruchamiana jest zaprogramowana metoda rozpoznania kolumny HI w celu pobrania próbki frakcji eit. Na koniec EIT jest analizowany i identyfikowana jest optymalna kolumna hi i media na podstawie zaobserwowanych cech separacji. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na preferowane podłoże kolumnowe HI do skalowanego oczyszczania białka będącego przedmiotem zainteresowania badacza za pomocą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem zautomatyzowanych funkcji wyszukiwania kolumn HI przepływu DUO.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekwencyjne przebiegi ręcznej chromatografii kolumnowej, jest to, że automatyzacja procesu zmniejsza zmienność i zapewnia wysoce powtarzalne wyniki. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności ze względu na fizyczną złożoność nowoczesnych systemów chromatografii cieczowej. Można to jednak łatwo opanować.

Po wystarczającej praktyce Procedurę zademonstrują Orange Stone i Shelly Anderson, dwoje studentów z mojego laboratorium Aby rozpocząć, przygotuj 500 mililitrów następujących, 200 milimolowy fosforan sodu jako bufor, jeden 200 milimolowy wodorofosforan sodu dla buforu A dwa i 4,8 molowy siarczan amonu. W przypadku buforu B dwie wody dejonizowane będą działać jako bufor B, jeden odgazowuje, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. Maksymalizator systemu zmiesza ze sobą A jeden i A dwa, aby wytworzyć bufor elucyjny o niskiej zawartości soli, a także zmiesza B jeden i B dwa w celu wytworzenia siarczanu amonu o wysokiej zawartości soli.

Bufor startowy. Przygotować 20 mililitrów próbki do obciążenia, mieszając 10 mililitrów lizatu komórkowego zawierającego białko, które ma być oczyszczone, z 10 mililitrami buforu B dwa. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2,4 mola, co czyni je w przybliżeniu równoważnym buforowi startowemu.

Przefiltrować mieszaninę buforu lizatu przez filtr strzykawkowy o niskiej wiązalności białka 0,45 mikrometra, aby usunąć cząstki stałe z roztworu. Próbkę należy przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie gotowa do wprowadzenia do systemu. Fizyczna konfiguracja i instalacja wodno-kanalizacyjna systemu chromatograficznego jest jednym z najbardziej skomplikowanych aspektów tej procedury.

Skonfiguruj system podwójnej chromatografii przepływowej zgodnie ze schematem pokazanym tutaj. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie objętości bufora dla całego protokołu i że rurki będą nadal zanurzone. Ustawić zawór ładowania próbki w pionie i dynamiczną pętlę próbki, jak pokazano tutaj, podłączyć pętlę próbki do wlotu zaworu próbki w pozycji trzeciej.

Przygotuj osiem par o identycznych rozmiarach jednej rurki szczytowej o średnicy zewnętrznej 16 cali. Następnie podłącz pary do pozycji od pierwszej do ósmej z dwóch kolumnowych zaworów selekcyjnych. Po włączeniu lamp detektora UV i upewnieniu się, że wszystkie detektory są skalibrowane, podłącz zawór rozdzielacza strumienia kolektora frakcji i sterownik rozdzielacza, jak pokazano na ilustracji. Tu.

Zawór rozdzielacza kolektora frakcji w pozycji drugiej i sterownik rozdzielacza są obsługiwane w trybie offline stacji roboczej chromatografii. Ustaw podział procentowy na 10. Wymień standardową głowicę opuszczającą kolektora frakcji na pozycji drugiej na głowicę kroplową z mikropłytką.

Przepłukać pętlę próbki i przepłukać system chromatograficzny. Następnie uruchom ręczny przepływ bufora ewolucyjnego o wartości jednego mililitra na minutę przez system. Podłącz kolumny HI o wysokości jednego mililitra do pozycji od drugiej do ósmej zaworów wyboru kolumny.

Usuń złączkę łączącą dwie kolumny zaworów selekcyjne w pozycji. Przymocuj złączki kolumny przed kolumną do podwójnego przepływu. Przeprowadź bufor objaśniający przez złączki, aż całe powietrze zostanie usunięte i pojawi się duża kropla bufora.

Następnie usuń korek podłączony do wlotu kolumny i umieść dużą kroplę buforu o niskiej zawartości soli na górze kolumny. Następnie przymocuj kolumnę do złączek poprzedzających. Podłącz wylot do złączek kolumny wylotowej i rurki zaworu selekcyjnego.

Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 PS. Myję kolumnę pięcioma objętościami kolumn. Bufor ewolucyjny o natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Przemyć kolumnę 10 objętościami buforu startowego przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę.

Po ustabilizowaniu się pH, UV i ciśnienia wstecznego należy ręcznie przełączyć zawory wyboru kolumny w położenie pierwsze i zatrzymać przepływ bufora. Aby załadować próbkę, zanurz rurkę wlotową próbki w próbce o pojemności 20 mililitrów. Następnie przełącz zawór myjący obciążenia pętli próbki na pozycję pierwszą, a zawór ładowania próbki na przedmuchiwanie.

Zainicjować działanie pompy ładującej pętlę próbki, wciągając próbkę do rurki pompy z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę, aż natychmiast po tym, jak próbka dotrze do zaworu ładującego próbkę. Przełącz zawór ładowania próbki z przedmuchiwania na ładowanie. Uruchom ponownie pompę ładującą pętlę próbki z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę, aż 10 mililitrów próbki zostanie wciągniętych do dynamicznej pętli próbki Z okna konfiguracji w oprogramowaniu biologicznym.

Wybierz urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w tej tabeli. Następnie wybierz sześć kolumn HIC do programu testowego. Liniowy malejący gradient soli i sześciokolumnowa metoda rozpoznania ręcznie rozpoczynają początkowy przepływ bufora z prędkością jednego mililitra na minutę.

Naciśnij start na kontrolerze rozdzielacza, aby rozpocząć dzielenie strumienia od 90% do 10% EIT natychmiast po uruchomieniu metody programu, uruchom naciśnij start na ekranowym panelu sterowania 96-dołkowego kolektora frakcji płytkowej offline. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry pracy. Porównaj śledzenie absorbancji specyficznej dla GFP 397 nanometrów z ogólnym śledzeniem absorbancji białka 280 nanometrów w celu oszacowania względnej separacji i oczyszczania przy użyciu różnych badanych pożywek HI podwielokrotności od pięciu do 50 mikrolitrów z 96-dołkowych frakcji płytki można przenieść na świeżą płytkę i oznaczyć zawartość określonego białka za pomocą Elizy lub Western blot i całkowitej zawartości białka przy użyciu strony SDS lub reprezentatywnego systemu elektroforezy mikroprzepływowej Experian, soli hick Przewodność gradientowa i ciśnienie w kolumnie przebiegów zwiadowczych są pokazane tutaj.

Zmiana stężenia soli mierzona procentem buforu pobranego z linii buforowych o wysokiej zawartości soli jest typowa dla metodologii HI. Wraz ze spadkiem stężenia soli białka związane z przewodnością elucji kolumny, która odpowiada obserwowanej, stężenie soli mierzy się zgodnie z linią bezpośrednio po czujnikach quad tech i UV. Przesunięcie między gradientem soli a śledzeniem przewodności wskazuje czas potrzebny na przebycie buforu od wlotu buforu przez system do monitora przewodności.

Przez cały czas trwania próbki ciśnienie w układzie i pH pozostają względnie stałe. Rysunek ten przedstawia chromatogramy sekwencyjnego przeszukiwania kolumny HI, które przeprowadza inline detekcję białka całkowitego. NGFP uzyskuje się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nanometrach i 397 nanometrach.

Możliwe jest przybliżenie względnej liczebności i separacji GFP dla każdego biegu zwiadowczego. Porównując dwie linie w probówkach hodowlanych na tym rysunku dla frakcji, 10, 12, 14, 16 i 18 przebiegu zwiadowczego FF kopru włoskiego zwiazulizowano w świetle otoczenia lub fluorescencyjnym pomieszczeniu, a lampy światła ultrafioletowego oglądano zarówno przodem, jak i górą do dołu, aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisyjne GFP, GFP jest wyraźnie wykrywany we frakcji 14. Na obu obrazach UV rozmyty niebieski kolor w lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV.

Te dane po uruchomieniu dobrze korespondują z wykrywaniem GFP w linii produkcyjnej poprzez pomiar absorbancji eluidów przy 397 nanometrach, który również identyfikuje frakcję 14 jako zawierającą główny pik wspomnianego GFP. Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak western blotting, Eliza, mikroskopia sił atomowych i testy rekonstytucji biochemicznej, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania związane z czystością i aktywnością funkcjonalną oczyszczanego białka.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o konieczności ręcznego sterowania systemem podwójnego przepływu w kilku punktach metody. Przykłady obejmują uzupełnianie buforu i ładowanie próbki, sprawdzanie, czy nie ma pęcherzyków powietrza oraz włączanie i wyłączanie lampek detekcyjnych w razie potrzeby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać systemu chromatografii cieczowej do przeprowadzania automatycznego wyszukiwania optymalnych kolumn i mediów HI.

Ewaluowana analiza w linii i na plakacie pozwoli badaczowi wybrać odpowiednią kolumnę do późniejszego oczyszczania w górę, które można również połączyć z innymi metodami chromatograficznymi w celu zwiększenia czystości i wydajności białka docelowego.