Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wybór optymalnej kolumny do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HI) przy użyciu zautomatyzowanej metody przesiewowej (scouting) w celu oczyszczania rekombinowanego białka za pomocą systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej BioRad DUO flow. Osiąga się to poprzez przygotowanie niezbędnych buforów oraz lizatów bakteryjnych zawierających interesujące białko rekombinowane. Następnie system chromatograficzny duo flow zostaje fizycznie zainstalowany, podłączony i przygotowany do realizacji protokołu przesiewowego.

Następnie nanosi się próbki i uruchamia zaprogramowaną metodę poszukiwawczą dla kolumny HI w celu zebrania frakcji próbki eit. Na koniec analizuje się EIT i identyfikuje optymalną kolumnę HI oraz wypełnienie na podstawie zaobserwowanych charakterystyk rozdziału. W rezultacie można uzyskać wyniki wskazujące preferowane wypełnienie kolumny HI do skalowania oczyszczania białka badanego przez badacza za pomocą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, wykorzystując zautomatyzowane możliwości poszukiwania kolumn HI w systemie DUO flow.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak sekwencyjne przeprowadzanie ręcznej chromatografii kolumnowej, jest fakt, że automatyzacja procesu zmniejsza zmienność i zapewnia wysoką powtarzalność wyników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotykać trudności ze względu na złożoność konstrukcyjną nowoczesnych systemów chromatografii cieczowej. Można ją jednak łatwo opanować.

Po odpowiednim przeszkoleniu procedurę zademonstrują Orange Stone i Shelly Anderson, dwoje studentów z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować 500 ml następujących buforów: 200 mM fosforanu sodu dla buforu A1, 200 mM wodorofosforanu sodu dla buforu A2 oraz 4,8 M siarczanu amonu dla buforu B2; jako bufor B1 posłuży woda dejonizowana. Odgazuj bufory, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. System Maximizer zmiesza bufory A1 i A2 w celu wytworzenia fosforanowego buforu elucyjnego o niskim stężeniu soli, a bufory B1 i B2 zmiesza w celu wytworzenia siarczanu amonu o wysokim stężeniu soli.

Bufor startowy. Przygotuj 20 mililitrów próbki do nałożenia, mieszając 10 mililitrów lizatu komórkowego zawierającego białko do oczyszczenia z 10 mililitrami buforu B dwa. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2,4 molar, co czyni go w przybliżeniu równoważnym buforowi startowemu.

Przefiltruj mieszaninę buforu do lizatu przez strzykawkę z filtrem 0,45 µm o niskim wiązaniu białek, aby usunąć z roztworu cząstki stałe. Próbkę przechowuj w lodzie do momentu wprowadzenia jej do systemu. Konfiguracja fizyczna i połączenia hydrauliczne systemu chromatograficznego stanowią jeden z najbardziej skomplikowanych etapów tej procedury.

Skonfiguruj system chromatografii duo flow zgodnie z przedstawionym tutaj schematem. Upewnij się, że dostępna jest odpowiednia ilość buforu na cały protokół oraz że rurki pozostaną zanurzone. Podłącz zawór ładowania próbki i dynamiczną pętlę próbkową zgodnie z ilustracją, a następnie podłącz pętlę próbkową do wlotu zaworu próbkowego w pozycji trzeciej.

Przygotuj osiem par identycznie dociętych odcinków rurek PEEK o średnicy zewnętrznej 1/16 cala. Następnie podłącz pary do gniazd od pierwszego do ósmego dwóch zaworów wyboru kolumny. Po włączeniu lamp detektora UV i potwierdzeniu kalibracji wszystkich detektorów, podłącz zawór rozdzielacza strumienia oraz sterownik rozdzielacza zbieracza frakcji, zgodnie z ilustracją przedstawioną tutaj.

Zawór rozdzielający i sterownik rozdzielacza kolektora frakcji w pozycji drugiej są obsługiwane niezależnie od stacji roboczej do chromatografii. Ustaw wartość podziału procentowego na 10. Zastąp standardową głowicę dozującą kolektora frakcji w pozycji drugiej głowicą do mikropłytek.

Przepłucz pętlę próbkową i system chromatograficzny. Następnie uruchom manualny przepływ buforu elucyjnego przez system z prędkością 1 ml/min. Podłącz kolumny HI trap 1 ml do pozycji od drugiej do ósmej zaworów wyboru kolumn.

Zdejmij złączkę łączącą zawory wyboru kolumn w pozycji drugiej. Podłącz złączki kolumny dopływowej do modułu duo flow. Przepuść bufor eluujący przez złączki, aż do całkowitego usunięcia powietrza i pojawienia się dużej kropli buforu.

Następnie należy wyjąć zatyczkę podłączoną do wlotu kolumny i nanieść dużą kroplę buforu o niskim zasoleniu na górną część kolumny. Następnie podłączyć kolumnę do przyłączy dopływowych. Wylot należy podłączyć do przyłączy odpływowych kolumny oraz do przewodów zaworu wyboru.

Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 PS.I. Przemyj kolumnę pięcioma objętościami kolumny buforu elucyjnego przy szybkości przepływu 1 ml/min. Przemyj kolumnę 10 objętościami kolumny buforu startowego przy szybkości przepływu 1 ml/min.

Po ustabilizowaniu się zapisów pH i UV oraz ciśnienia wstecznego, ręcznie przełącz zawory wyboru kolumny w pozycję jeden i zatrzymaj przepływ buforu. Aby załadować próbkę, zanurz rurkę wlotową próbki w 20 mililitrach próbki. Następnie przełącz zawór płukania pętli załadunkowej próbki w pozycję jeden, a zawór załadunku próbki w pozycję płukania.

Uruchom pompę załadunkową pętli próbkowej, pobierając próbkę do przewodów pompy z przepływem 1 ml/min aż do momentu, gdy próbka dotrze do zaworu załadunkowego. Przełącz zawór załadunkowy z pozycji płukania (purge) na pozycję załadunku (load). Ponownie uruchom pompę załadunkową pętli próbkowej z przepływem 1 ml/min aż do pobrania 10 ml próbki do dynamicznej pętli próbkowej z poziomu okna konfiguracji w oprogramowaniu biologic.

Wybierz urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w poniższej tabeli. Następnie wybierz sześć kolumn HIC do zaprogramowania analizy. Liniowy gradient malejący stężenia soli oraz metoda wstępnego przeszukania sześciu kolumn ręcznie rozpoczynają przepływ buforu startowego z prędkością jeden mililitr na minutę.

Naciśnij przycisk start na kontrolerze rozdzielacza, aby rozpocząć rozdzielanie strumienia EIT w stosunku od 90% do 10%; bezpośrednio po uruchomieniu programu metody naciśnij przycisk start na ekranie panelu sterowania offline’owego kolektora frakcji do płytek 96-dołkowych. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry procesu. Porównaj zapis absorbancji przy 397 nanometrach specyficznej dla GFP z ogólnym zapisem absorbancji białek przy 280 nanometrach, aby oszacować względny stopień rozdziału i oczyszczania przy użyciu różnych badanych mediów HI. Alikwoty od 5 do 50 µL z frakcji na płytce 96-dołkowej można przenieść na nową płytkę i poddać analizie w celu oznaczenia specyficznej zawartości białka metodą ELISA lub Western blot oraz całkowitej zawartości białka za pomocą SDS-PAGE lub mikrofluidycznego systemu elektroforezy Experian. Tutaj przedstawiono reprezentatywne gradienty przewodności soli oraz ciśnienie kolumny z przebiegów wstępnych.

Zmiana stężenia soli, mierzona jako procent buforu pobieranego z linii buforu o wysokim zasoleniu, jest charakterystyczna dla metodologii HI. Wraz ze spadkiem stężenia soli białka związane z kolumną eluują wraz z przewodnością; mierzona w linii bezpośrednio za detektorami quad tech i UV stężenie soli odpowiada temu, co zaobserwowano. Przesunięcie między gradientem soli a zapisami przewodności wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu z wlotu buforu przez system do monitora przewodności.

W trakcie analizy próbki ciśnienie systemowe oraz pH pozostają względnie stałe. Na tym rysunku przedstawiono chromatogramy z sekwencyjnych przebiegów rozpoznawczych kolumny HI z detekcją całkowitego białka w układzie. Wykrywanie NGFP odbywa się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nanometrach i 397 nanometrach.

Możliwe jest przybliżenie względnej zawartości i separacji GFP dla każdego przebiegu rozpoznawczego. Poprzez porównanie dwóch linii na tym rysunku, probówki z kulturami dla frakcji 10, 12, 14, 16 i 18 z przebiegu rozpoznawczego FF kopru były wizualizowane w świetle pokojowym (rozproszonym lub fluorescencyjnym) oraz pod lampami ultrafioletowymi; próbki oglądano zarówno od przodu, jak i z góry, aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisji GFP. GFP jest wyraźnie wykrywalne w frakcji 14. Na obu obrazach UV rozproszony kolor niebieski w lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV.

Te dane uzyskane po analizie dobrze korelują z detekcją GFP w trybie on-line poprzez pomiar absorbancji eluatu przy 397 nanometrach, co również wskazuje, że frakcja 14 zawiera główny pik eluowanego GFP. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak western blotting, testy ELISA, mikroskopia sił atomowych oraz biochemiczne testy rekonstytucji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące czystości i aktywności funkcjonalnej oczyszczanego białka.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o konieczności ręcznego sterowania systemem podwójnego przepływu w kilku punktach metody. Przykłady obejmują uzupełnianie buforu i ładowanie próbek, sprawdzanie obecności pęcherzyków powietrza oraz włączanie i wyłączanie lamp detekcyjnych w razie potrzeby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania systemu chromatografii cieczowej do zautomatyzowanego poszukiwania optymalnych kolumn i wypełnień HI.

Analiza wyników z linii bazowej i plakatu pozwoli badaczowi wybrać odpowiednią kolumnę do późniejszej puryfikacji w większej skali, którą można również połączyć z innymi metodami chromatograficznymi w celu zwiększenia czystości i wydajności docelowego białka.