Name: Zautomatyzowany wybór kolumny chromatograficznej do chromatografii oddziaływań hydrofobowych do stosowania w oczyszczaniu białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę wyboru kolumny HIC do oczyszczania białek rekombinowanych. Technika wykorzystuje system chromatografii cieczowej średniego ciśnienia, zwiększając powtarzalność i efektywność procesu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu National Institutes of Health GM086822 oraz grantu National Science Foundation na główną aparaturę badawczą DBI-0960313. Autorzy chcieliby podziękować dr. Jonowi Miyake i dr Donnie Hardy (Bio-Rad) oraz dr Jennifer Loertscher (Seattle University) za ich wiedzę techniczną. Wybrane odczynniki do chromatografii oraz dodatkowa aparatura zostały hojnie udostępnione przez firmę Bio-Rad.

<ol><li>Cummins, P. M., O'Connor, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).</li>
<li>Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+modeling+of+nonlinear+hydrophobic+interaction+chromatographic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).</li>
<li>To, B. C., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins.+IV.+Protein+adsorption+capacity+and+transport+in+preparative+mode%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode.</a> J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).</li>
<li>Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+mild+hydrophobic+interaction+chromatography+for+%22method+scouting%22+protein+purification+strategies+in+aqueous+two-phase+systems%3A+a+study+using+model+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins.</a> Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).</li>
<li>Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+proteins+in+receptor+research%3A+an+emerging+tool+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).</li>
<li>Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.A+Protocol+for+the+Production+of+KLRG1+Tetramer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer.</a> J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+Magnetosome+Associated+Protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41.</a> J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).</li>
<li>Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automatic+system+for+multidimensional+integrated+protein+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).</li>
<li>Camper, D. V., Viola, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fully automated protein purification.</a> Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).</li>
<li>Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+green+fluorescent+protein+screen+for+identification+of+well-expressed+membrane+proteins+from+a+cohort+of+extremophilic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms.</a> Protein Sci. 18, 121-133 (2009).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+and+red+fluorescent+proteins+to+teach+protein+expression%2C+purification%2C+and+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Educ%22%5BJournal%5D)">Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization.</a> Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).</li>
<li>Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+interaction+chromatography+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic interaction chromatography of proteins.</a> J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).</li>
<li>McCue, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+use+of+hydrophobic+interaction+chromatography+in+protein+purification+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications.</a> Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).</li>
</ol>

Wybrane odczynniki do chromatografii oraz dodatkowa aparatura zostały dostarczone przez firmę Bio-Rad.

Techniki chromatografii cieczowej okazały się nieocenione w przygotowywaniu wysoko oczyszczonych białek niezbędnych do prowadzenia badań immunologicznych 6, biochemicznych 7 oraz strukturalnych 8. Metody oczyszczania za pomocą HIC najczęściej wymagają empirycznego wyznaczenia optymalnego medium, a wykazano, że na wyniki chromatograficzne wpływają struktura ligandu, gęstość ligandu oraz właściwości kulek matrycy 2, 3. Zautomatyzowany dobór kolumny (column scouting) jest efektywnym podejściem do wyboru medium HIC do późniejszej optymalizacji i oczyszczania białek 4. Przedstawiona metoda zautomatyzowanego doboru kolumn może być łatwo dostosowana do różnych strategii oczyszczania białek metodą HIC. Warunki oczyszczania mogą zostać dodatkowo ulepszone poprzez zmiany stężenia soli, wybór rodzaju soli, gradientu soli oraz pH, a wpływ tych kluczowych parametrów został omówiony w poprzednich przeglądach 13,14. Eluat HIC zawierający częściowo oczyszczone białko docelowe może zostać poddany dalszemu oczyszczaniu przy użyciu komplementarnej techniki chromatograficznej, takiej jak chromatografia wymiany jonowej (IEX) lub filtracja żelowa/chromatografia wykluczaniaC 9,10.
Ze względu na unikalne charakterystyki absorpcji i emisji światła, profil elucji GFP można zidentyfikować, stosując podejścia in-line oraz post-run. W tym celu niniejszy protokół można dalej dostosować do oczyszczania rekombinowanych białek fuzyjnych z GFP, w których niepowiązane białko docelowe jest „oznaczone” GFP. Białka docelowe oznakowane GFP mogą być wykrywane za pomocą światła UV 11 i oczyszczane przy użyciu różnych metod chromatograficznych, w tym opisanej powyżej strategii oczyszczania HIC. Oczyszczanie GFP stało się również stałym elementem dydaktycznym w laboratoriach biochemicznych, służącym do nauczania nowoczesnych technik nauki o białkach 12.
Choć podstawowa puryfikacja białek metodą HIC może być przeprowadzona przy użyciu znacznie mniej zaawansowanego systemu chromatograficznego, instrumentarium przedstawione w niniejszym opracowaniu oferuje szereg wyraźnych zalet ułatwiających uzyskanie korzystnych wyników. Do istotnych korzyści płynących z wykorzystania systemu wysoko zautomatyzowanego należą: lepsza powtarzalność warunków między poszczególnymi przebiegami, oszczędność czasu oraz mniejsze ryzyko wprowadzenia powietrza do układu 10. Sterowane systemowo mieszanie buforów, realizowane przez moduł maximizer, pozwala na zwiększenie spójności przygotowania buforów oraz powtarzalności eksperymentalnej. Pobranie wystarczającej ilości próbki do dynamicznej pętli próbkowej na wszystkie przebiegi wstępne (scouting runs) zapewnia dodatkowo jednorodność próbki wprowadzanej na każdą kolumnę i umożliwia sekwencyjne uruchamianie analiz bez przerw lub konieczności ręcznego ponownego ładowania. Kontrolowany wtrysk próbki z pętli na kolumnę zmniejsza zmienność, która może wystąpić podczas ręcznego nakładania próbki. Para zaworów wyboru kolumny pozwala na następujące po sobie przebiegi z użyciem różnych kolumn HIC bez konieczności ponownego łączenia przewodów w systemie. Analiza wielodługościowa jest szczególnie korzystna podczas badania białek o unikalnym profilu spektrofotometrycznym. Poza GFP, techniką tą mogą odnieść korzyść cytochromy, flawoproteiny oraz inne białka zawierające hem. Urządzenia do monitorowania przewodnictwa i pH pozwalają na weryfikację warunków eksperymentalnych w czasie rzeczywistym. Rozdzielczy system zbierania frakcji eluatem pozwala na lepszą obsługę frakcji i umożliwia łatki transfer do metod analizy po-runowej wymagających minimalnej objętości próbki (np. ELISA, SDS-PAGE, western blot oraz mikroprzepływowa elektroforeza Experion). Chociaż obsługa drugiego kolektora frakcji w trybie offline wymaga ręcznej synchronizacji, zapewnia ona maksymalną elastyczność w wyborze kolektora. Najistotniejszymi wadami wykorzystania tak zaawansowanego systemu chromatograficznego do doboru kolumny HIC i puryfikacji białek są początkowe nakłady czasu i funduszy związane z zakupem instrumentu oraz szkoleniem operatora.
Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje system chromatograficzny Bio-Rad DuoFlow; jednak można również zastosować równie wydajną aparaturę od innych producentów, taką jak ÄKTA Avant firmy GE Healthcare, która pozwala na uzyskanie równoważnych wyników. Nawet porównywalne systemy chromatograficzne posiadają unikalne cechy (np. programowanie metod, nomenklaturę komponentów, preferencje operatora oraz ograniczenia w zakresie skalowalności), które należy wziąć pod uwagę przed rozpoczęciem procedury oczyszczania lub zakupem urządzenia.

<table><tbody><tr><td>System BioLogic DuoFlow Pathfinder 20</td><td>Bio-Rad</td><td>7602257</td><td>Obejmuje: system maximizer, mieszalnik, stację roboczą F10, zawór AVR7-3, detektor UV/Vis QuadTec z celą przepływową, kolektor frakcji BioFrac, oprogramowanie BioLogic oraz zestaw startowy</td></tr><tr><td>Zawór wyboru strumienia AVR9-8</td><td>Bio-Rad</td><td>7600408</td><td></td></tr><tr><td>Zawór przekierowujący SV3-2</td><td>Bio-Rad</td><td>7500410</td><td></td></tr><tr><td>Zawór rozdzielający strumień</td><td>Bio-Rad</td><td>7410017</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DynaLoop 25</td><td>Bio-Rad</td><td>7500451</td><td></td></tr><tr><td>Kolektor frakcji BioFrac</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>Użyto dwóch kolektorów frakcji</td></tr><tr><td>Adapter głowicy kroplującej do mikropłytek BioFrac</td><td>Bio-Rad</td><td>74010088</td><td></td></tr><tr><td>Adapter do płytek mikrotitracyjnych BioFrac</td><td>Bio-Rad</td><td>7410017</td><td></td></tr><tr><td>Moduł optyki UV</td><td>Bio-Rad</td><td>7500202</td><td></td></tr><tr><td>Lampa halogenowa</td><td>Bio-Rad</td><td>7601331</td><td></td></tr><tr><td>Pompa gradientowa Econo</td><td>Bio-Rad</td><td>7319001</td><td></td></tr><tr><td>System Experion</td><td>Bio-Rad</td><td>7007001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw analityczny Experion Pro260</td><td>Bio-Rad</td><td>7007102</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wyboru kolumn HiTrap HIC</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4110-07</td><td>Obejmuje 7 x 1 ml wstępnie napełnionych kolumn z wypełnieniem HIC do celów screeningowych</td></tr><tr><td>Złączki kolumn GE Healthcare do Bio-Rad</td><td>GE Healthcare</td><td>18111251 i 18111257</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

W przeciwieństwie do innych metod chromatograficznych służących do oczyszczania białek (np. filtracji żelowej, powinowactwa i wymiany jonowej), chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) zazwyczaj wymaga wyznaczenia eksperymentalnego (zwanego przesiewaniem lub „rozpoznaniem”), aby wybrać najodpowiedniejsze medium chromatograficzne do oczyszczenia danego białka 1. Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu opisuje zautomatyzowane podejście do wyszukiwania optymalnego medium HIC do zastosowania w oczyszczaniu białek.
HIC oddziela białka i inne biomolekuły od surowego lizatu na podstawie różnic w hydrofobowości. Podobnie jak chromatografia powinowactwa (AC) i chromatografia wymiany jonowej (IEX), HIC umożliwia zagęszczenie białka docelowego w trakcie procesu chromatograficznego. Do oczyszczania metodą HIC najlepiej nadają się białka posiadające hydrofobowe regiony powierzchniowe oraz zdolne do zniesienia ekspozycji na stężenia soli przekraczające 2 M siarczanu amonu ((NH4)2SO4). HIC jest często wybierana jako metoda oczyszczania białek pozbawionych znaczników powinowactwa, co czyni je nieodpowiednimi do AC, a także w sytuacjach, gdy IEX nie zapewnia wystarczającego stopnia oczyszczenia. Hydrofobowe grupy na powierzchni białka wiążą się tymczasowo z niepolarnym ligandem sprzężonym z obojętną, nieruchomą matrycą. Oddziaływanie między białkiem a ligandem jest silnie zależne od stężenia soli w buforze przepływającym przez kolumnę chromatograficzną, przy czym wysokie stężenia jonowe wzmacniają oddziaływanie białko-ligand i unieruchamiają białko (tzn. wiążą je wewnątrz kolumny) 2. Wraz ze spadkiem stężenia soli oddziaływanie białko-ligand zanika, białko ponownie staje się ruchome i eluiuje z kolumny. Kilka rodzajów wypełnień HIC jest dostępnych komercyjnie w kolumnach wstępnie wypełnionych, z których każda zawiera jeden z kilku ligandów hydrofobowych (np. S-butylowy, butylowy, oktylowy i fenylowy) sieciowanych z różną gęstością do kuleczek agarozy o określonej średnicy 3. Zautomatyzowany screening kolumn pozwala na efektywne określenie, które wypełnienie HIC należy zastosować w przyszłych, bardziej szczegółowych eksperymentach optymalizacyjnych i procesach oczyszczania białek 4.
Białkiem poddanym w tym przypadku oczyszczaniu jest rekombinowane zielone białko fluorescencyjne (GFP); podejście to można jednak dostosować do oczyszczania innych białek posiadających jeden lub więcej hydrofobowych regionów powierzchniowych. GFP służy jako przydatne białko modelowe ze względu na swoją stabilność, unikalny pik absorbancji światła przy 397 nm oraz fluorescencję pod wpływem światła UV 5. Lizat bakteryjny zawierający GFP typu dzikiego przygotowano w buforze o wysokim zasoleniu, wprowadzono do systemu średniociśnieniowej chromatografii cieczowej Bio-Rad DuoFlow i zaadsorbowano na kolumnach HiTrap HIC zawierających różne media HIC. Białko eluowano z kolumn i analizowano za pomocą metod detekcji on-line oraz po zakończeniu procesu. Mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki przez pętlę, sekwencyjny wybór kolumny, analiza wielodługościowa oraz zbieranie frakcji eluatu w rozdzielaczach zwiększyły funkcjonalność systemu i powtarzalność podejścia eksperymentalnego.

Przedstawiono zautomatyzowaną metodę identyfikacji odpowiednich wypełnień do chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HIC) do wykorzystania w procesie oczyszczania białek. Metoda ta wykorzystuje system średniociśnieniowej chromatografii cieczowej obejmujący zautomatyzowane mieszanie buforów, dynamiczny wtrysk próbki z pętli, sekwencyjny wybór kolumn, analizę wielodługościową oraz rozdzielcze zbieranie frakcji eluatu.

Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

W przeciwieństwie do innych metod chromatograficznych stosowanych do oczyszczania białek (np. filtracji żelowej, powinowactwa oraz wymiany jonowej), oddziaływanie hydrofobowe...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wybór optymalnej kolumny do chromatografii cieczowej HI przy użyciu zautomatyzowanej metody przesiewowej (scouting method) w celu oczyszczania białka rekombinowanego za pomocą systemu do średniociśnieniowej chromatografii cieczowej BioRad DUO flow. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez wstępne przygotowanie niezbędnych buforów oraz lizatów bakteryjnych zawierających analizowane białko rekombinowane. Następnie system chromatograficzny duo flow jest fizycznie konfigurowany, podłączany i przygotowywany do realizacji protokołu przesiewowego.Następnie wprowadza się próbki i uruchamia zaprogramowaną metodę przesiewową dla kolumny HI w celu zebrania frakcji elucji (EIT). Na koniec analizuje się EIT i na podstawie zaobserwowanych charakterystyk rozdziału identyfikuje się optymalną kolumnę HI oraz wypełnienie. W rezultacie można uzyskać dane wskazujące preferowane wypełnienie kolumny HI do skalowanego oczyszczania białka badanego przez naukowca za pomocą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej, wykorzystując zautomatyzowane możliwości przesiewowe kolumn HI systemu DUO flow.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak sekwencyjne prowadzenie ręcznej chromatografii kolumnowej, jest to, że automatyzacja procesu zmniejsza zmienność i zapewnia wysoką odtwarzalność wyników. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na złożoność konstrukcyjną nowoczesnych systemów chromatografii cieczowej. Można jednak szybko opanować obsługę tych urządzeń.Po odpowiednim przeszkoleniu procedurę zademonstrują Orange Stone i Shelly Anderson, dwoje studentów z mojego laboratorium. Na początku należy przygotować 500 mililitrów następujących buforów: 200 milimolarny fosforan sodu jako bufor A1, 200 milimolarny wodorofosforan sodu jako bufor A2 oraz 4,8 molarny siarczan amonu jako bufor B2; woda dejonizowana będzie pełnić funkcję bufora B1. Bufory należy odgazować, aby zapewnić optymalne warunki pracy chromatograficznej. System Maximizer zmiesza bufory A1 i A2 w celu wytworzenia niskosolowego fosforanowego buforu elucyjnego, a także zmiesza bufory B1 i B2 w celu wytworzenia wysokosolowego buforu siarczanu amonu.Bufor startowy. Przygotuj 20 mililitrów próbki do nałożenia, mieszając 10 mililitrów lizatu komórkowego zawierającego białko do oczyszczenia z 10 mililitrami buforu B dwa. Końcowe stężenie siarczanu amonu w roztworze próbki lizatu komórkowego powinno wynosić około 2,4 molar, co sprawi, że będzie on w przybliżeniu równoważny buforowi startowemu.Przefiltruj mieszaninę buforu do lizy przez strzykawkowy filtr 0,45 µm o niskiej wiązalności białek, aby usunąć z roztworu zanieczyszczenia stałe. Przechowuj próbkę w lodzie do momentu wprowadzenia jej do systemu. Konfiguracja fizyczna i hydraulika systemu chromatograficznego stanowią jeden z najbardziej skomplikowanych etapów tej procedury.Skonfiguruj system chromatografii duo flow zgodnie z przedstawionym tutaj schematem. Upewnij się, że dostępne są odpowiednie objętości buforu na cały protokół oraz że końcówki przewodów pozostaną zanurzone. Podłącz zawór załadunkowy próbki oraz dynamiczną pętlę próbki zgodnie z ilustracją, łącząc pętlę próbki z wlotem zaworu próbkowania w pozycji trzeciej.Przygotować osiem par identycznie dociętych odcinków rurek PEEK o średnicy zewnętrznej 1/16 cala. Następnie połączyć pary te z pozycjami od jednej do ośmiu w dwóch zaworach wyboru kolumny. Po włączeniu lamp detektora UV i potwierdzeniu kalibracji wszystkich detektorów, podłączyć zawór rozdzielający strumień kolektora frakcji oraz kontroler rozdzielacza zgodnie z ilustracją.Tutaj.Zawór rozdzielający i kontroler rozdzielający kolektora frakcji w pozycji drugiej są obsługiwane poza stacją roboczą do chromatografii. Ustaw procent podziału na 10. Zastąp standardową głowicę dozującą kolektora frakcji w pozycji drugiej głowicą do mikro płytek.Przepłucz pętlę próbkową i oczyść system chromatograficzny. Następnie uruchom manualny przepływ buforu elucyjnego przez system z prędkością 1 ml/min. Podłącz kolumny HI trap o pojemności 1 ml do pozycji od drugiej do ósmej zaworów wyboru kolumn.Zdemontuj złączkę łączącą zawory wyboru kolumn w pozycji drugiej. Podłącz złączki kolumny znajdujące się po stronie dopływu do duo flow. Przepuść bufor elucyjny przez złączki, aż do całkowitego usunięcia powietrza i pojawienia się dużej kropli buforu.Następnie należy zdjąć korek z wlotu kolumny i nanieść dużą kroplę buforu o niskiej zawartości soli na górną część kolumny. Następnie podłączyć kolumnę do przyłączy doprowadzających. Wylot należy podłączyć do przyłączy kolumny odprowadzającej oraz do rurki zaworu wyboru.Ustaw limit ciśnienia wstecznego na 40 PS.I. Przemyj kolumnę pięcioma objętościami kolumny buforu elucyjnego przy szybkości przepływu 1 ml/min. Przemyj kolumnę 10 objętościami kolumny buforu początkowego przy szybkości przepływu 1 ml/min.Po ustabilizowaniu się zapisów pH i UV oraz ciśnienia wstecznego, ręcznie przełącz zawory wyboru kolumny w pozycję pierwszą i zatrzymaj przepływ buforu. Aby załadować próbkę, zanurz rurkę doprowadzającą próbkę w 20 mililitrach próbki. Następnie przełącz zawór płukania pętli załadunkowej próbki w pozycję pierwszą, a zawór załadunku próbki w pozycję purge.Uruchom pompę załadowującą pętlę próbkową, zasysając próbkę do cewki pompy z przepływem 1 ml/min, aż do momentu, gdy próbka dotrze do zaworu załadowującego. Przełącz zawór załadowujący próbkę z pozycji płukania (purge) na pozycję ładowania (load). Ponownie uruchom pompę załadowującą pętlę próbkową z przepływem 1 ml/min, aż do momentu zassania 10 ml próbki do dynamicznej pętli próbkową z poziomu okna konfiguracji w oprogramowaniu biologicznym.Wybierz urządzenia systemowe oznaczone gwiazdką w tej tabeli. Następnie wybierz sześć kolumn HIC do programu analizy. Liniowy malejący gradient soli oraz metoda rozpoznawcza dla sześciu kolumn ręcznie inicjują przepływ buforu startowego z prędkością 1 ml/min.Naciśnij start na sterowniku rozdzielacza, aby rozpocząć rozdzielanie strumienia EIT w zakresie od 90% do 10%. Natychmiast po uruchomieniu metody programu naciśnij start na ekranie panelu sterowania offline'owego kolektora frakcji do płytek 96-dołkowych. Obserwuj wyświetlacz w czasie rzeczywistym, aby potwierdzić przewidywane parametry przebiegu. Porównaj przebieg absorbancji przy 397 nm specyficznej dla GFP z przebiegiem absorbancji przy 280 nm dla ogólnych białek, aby oszacować względne rozdzielenie i oczyszczanie przy użyciu różnych testowanych mediów HI. Alikwoty od 5 do 50 µL z frakcji na płytce 96-dołkowej można przenieść na nową płytkę i oznaczyć zawartość specyficznego białka metodą ELISA lub Western blot oraz całkowitą zawartość białek za pomocą SDS-PAGE lub mikrofluidycznego systemu elektroforezy Experian. Tutaj przedstawiono reprezentatywne wartości przewodności gradientu soli HI oraz ciśnienia kolumny z przebiegów wstępnych.Zmiana stężenia soli, mierzona jako procent buforu pobieranego z linii buforów o wysokim zasoleniu, jest typowa dla metodologii HI. Wraz ze spadkiem stężenia soli białka związane z kolumną ulegają elucji, co odzwierciedla przewodność; stężenie soli jest mierzone w linii bezpośrednio za detektorami quad tech i UV. Przesunięcie między gradientem soli a zapisem przewodności wskazuje czas potrzebny na przemieszczenie się buforu od wlotu buforu przez system aż do monitora przewodności.Przez cały czas trwania analizy próbki ciśnienie systemowe oraz pH pozostają na stosunkowo stałym poziomie. Rysunek ten przedstawia chromatogramy z sekwencyjnych przebiegów rozpoznawczych kolumny HI z detekcją całkowitego białka w układzie przepływowym. Wykrywanie NGFP odbywa się poprzez pomiar absorbancji światła odpowiednio przy 280 nanometrach i 397 nanometrach.Możliwe jest przybliżenie względnej obfitości i separacji GFP dla każdego przebiegu rozpoznawczego. Poprzez porównanie dwóch linii na tej ilustracji, probówki z kulturami dla frakcji 10, 12, 14, 16 i 18 z przebiegu rozpoznawczego koperku FF zostały zwizualizowane w świetle otoczenia lub świetle fluorescencyjnym pomieszczenia oraz pod lampami ultrafioletowymi, patrząc zarówno od przodu, jak i z góry, aby zaobserwować charakterystyczne widmo emisji GFP; GFP jest wyraźnie wykrywane w frakcji 14. Na obu obrazach UV rozproszony niebieski kolor w lewym panelu UV to światło emitowane przez lampę UV.Te dane uzyskane po zakończeniu procesu dobrze korelują z detekcją GFP w czasie rzeczywistym poprzez pomiar absorbancji eluatu przy 397 nanometrach, co również wskazuje, że frakcja 14 zawiera główny pik eluowanego GFP. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak western blotting, testy ELISA, mikroskopia sił atomowych oraz testy biochemicznej rekompozycji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące czystości i aktywności funkcjonalnej oczyszczanego białka.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o konieczności ręcznego sterowania systemem podwójnego przepływu w kilku punktach metody. Przykłady obejmują uzupełnianie buforu i wprowadzanie próbek, sprawdzanie obecności pęcherzyków powietrza oraz włączanie i wyłączanie lamp detekcyjnych w razie potrzeby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania systemu chromatografii cieczowej do zautomatyzowanego poszukiwania optymalnych kolumn i wypełnień HI.Analiza przeprowadzona na podstawie parametrów linii bazowej i posteru pozwoli badaczowi na wybór odpowiedniej kolumny do późniejszej puryfikacji w większej skali, którą można również połączyć z innymi metodami chromatograficznymi w celu zwiększenia czystości i wydajności białka docelowego.

automated-hydrophobic-interaction-chromatography-column-selection-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Automatyczne wybieranie kolumn chromatografii na zasadzie hydrofobowej interakcji do stosowania w oczyszczaniu białek

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

W tym filmie pokazujemy oczyszczanie białka wiążącego wapń z dializowanego lizatu komórkowego za pomocą zależnej od wapnia chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Białka wiążące wapń odsłaniają obszar hydrofobowy po związaniu z wapniem, ułatwiając interakcję z grupą hydrofobową na żywicy. Później białka te są eluowane za pomocą chelatora wapnia EDTA, który odwraca interakcję.

Chromatografia oddziaływań hydrofobowych zależnych od wapnia: technika oczyszczania białek wiążących wapń na podstawie oddziaływań hydrofobowych

Ten film demonstruje zasadę rozdzielania hydrofilowych związków polarnych za pomocą hydrofilowej chromatografii cieczowej. Technika ta pomaga w oczyszczaniu różnych analitów polarnych, w tym N-glikanów.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych: technika rozdzielania hydrofilowych analitów polarnych za pomocą kulek hydrofilowych

Ten film demonstruje hydrofobową charakterystykę koniugatów przeciwciało-lek opartą na chromatografii cieczowej. Korzystając z kolumny chromatograficznej opartej na ligandzie butylowym, koniugaty przeciwciało-lek są charakteryzowane poprzez oddziaływania hydrofobowe z ligandem.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofobowych zależnych od butylu: technika charakteryzowania koniugatów przeciwciało-lek na podstawie oddziaływań hydrofobowych

Ten film prezentuje oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych lub SAPN oznaczonych histydyną za pomocą chromatografii cieczowej o powinowactwie. Uzyskane w ten sposób oczyszczone frakcje SAPN nadają się do opracowania szczepionek, co daje nadzieję na potencjalne zastosowania immunoterapeutyczne.

Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

Ekspresja i oczyszczanie białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu jest opisane przykładami (ekspresja w E. coli, FPLC). Oczyszczone białka są używane do krystalizacji i produkcji przeciwciał oraz wykorzystywane do testów enzymatycznych. Przedstawiono wybrane testy fotometryczne w celu wykazania wielofunkcyjności FAHD1 jako dekarboksylazy szczawiooctanu i hydrolazy acylopirogronianowej.

Ekspresja, oczyszczanie, krystalizacja i oznaczanie enzymatyczne białek zawierających hydrolazę hydrolazy fumaryloacetooctanu

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania dla rekombinowanego, bezznacznikowego białka wiążącego wapń S100A12 i jego indukowanych jonami oligomerów do testów stymulacji ludzkich monocytów.

Oczyszczanie S100A12 człowieka i jego indukowanych jonami oligomerów do stymulacji komórek odpornościowych

Adapter do płytek wielokolumnowych pozwala na połączenie kolumn chromatograficznych z wielodołkowymi płytkami do równoległego powinowactwa lub oczyszczania jonowymiennego, zapewniając ekonomiczną metodę oczyszczania białek o wysokiej przepustowości. Może być stosowany w warunkach grawitacji lub próżni, uzyskując miligramowe ilości białka za pomocą niedrogiego oprzyrządowania.

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

MamA jest unikalnym białkiem powiązanym z magnetosomami, o którym wykazano, że bierze udział w ich aktywacji. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół oczyszczania mutanta z delecją MamA (MamAΔ41) z M. magneticum AMB-1.

Oczyszczanie białka MamAΔ41 związanego z magnetosomami szczepu AMB-1 M. magneticum

Poznaj zautomatyzowaną metodę wyboru kolumny HIC do oczyszczania białek rekombinowanych. Technika wykorzystuje system chromatografii cieczowej średniego ciśnienia, zwiększając powtarzalność i efektywność procesu.

Zautomatyzowany wybór kolumny chromatograficznej do chromatografii oddziaływań hydrofobowych do stosowania w oczyszczaniu białek (Wideo) | JoVE Journal

Zautomatyzowany dobór kolumny do hydrofobowej chromatografii oddzielania w celu oczyszczania białek

Przeglądaj więcej filmów