Przygotowanie emulsji z adiuwantem antygenowym w celu wywołania autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego, EAE, jest chorobą ośrodkowego układu nerwowego. Autoprzeciwciała celują w glikoproteinę oligodendrocytów mieliny, MOG, na osłonce mielinowej neuronów, powodując niszczenie mieliny i zwyrodnienie nerwów.

Indukcja EAE u myszy wymaga wstrzyknięcia emulsji antygen-adiuwant autoantygenu MOG zmieszanej z adiuwantem - zawierającym antygen bakteryjny - w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

Aby przygotować emulsję, należy pobrać wodną zawiesinę MOG do probówki homogenizatora. Umieść probówkę na lodzie, zapobiegając degradacji antygenu.

Dodaj adiuwant — inaktywowane bakterie chorobotwórcze rozproszone w fazie olejowej. Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym. Wstrząsanie powoduje turbulencje w płynie, tworząc emulsję.

Pod mikroskopem emulsja pokazuje równomiernie zdyspergowane, mikro, wodne kropelki - zawierające MOG - w ciągłej fazie olejowej. Jednorodność emulsji zapewnia większą powtarzalność indukcji choroby.

Aby wstrzyknąć emulsję podatnemu szczepowi myszy, należy przymocować strzykawkę z przodu probówki i przenieść do niej emulsję. Weź znieczuloną mysz i wstrzyknij emulsję podskórnie.

Po wstrzyknięciu olej w emulsji zapewnia powolne i trwałe uwalnianie antygenu, wydłużając czas trwania odpowiedzi immunologicznej.

Inaktywowany patogen w emulsji powoduje miejscową reakcję zapalną, rekrutując komórki odpornościowe do miejsca wstrzyknięcia. Zrekrutowane komórki odpornościowe rozpoznają uwolniony antygen MOG i stymulują produkcję przeciwciał, co prowadzi do indukcji EAE.

Umieść zakręconą probówkę w odczynnikach, które mają być używane na lodzie. Następnie dodaj składniki emulsji. Najpierw PBS, następnie peptyd, zawiesina CFA, a na końcu IFA. Mocno zamknij rurkę z nakrętką, kilkakrotnie ją dokręcając i poluzowując. Potrząsaj energicznie probówką ręcznie przez 5 do 10 sekund, aby wstępnie wymieszać odczynniki.

Umieść probówkę w homogenizatorze wstrząsającym i zabezpiecz ją prętem. Ustaw prędkość na najwyższe ustawienie, a czas na 60 sekund. Po zakończeniu biegu umieść rurkę na lodzie na 3 minuty i powtórz bieg jeszcze 1 lub 2 razy z tymi samymi ustawieniami. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć uwięzione powietrze i zagęścić emulsję. Zdjąć nakrętkę z tubki, włożyć tłok do probówki i powoli wciskać go w dół, aż dotrze do górnej części emulsji. Zdejmij odciąganą obudowę na dole rurki, przekręcając ją.

Następnie należy usunąć tłok ze wszystkich strzykawek do wstrzykiwań i dodać igłę do strzykawek do wstrzykiwań. Następnie przymocować tylny koniec strzykawki do wstrzykiwania do dedykowanego zamka w dolnej części rurki i zablokować go krótkim przekręceniem. Przenieść emulsję z tubki do strzykawki iniekcyjnej, delikatnie naciskając tłok.

Zatrzymaj się, gdy emulsja osiągnie podziałkę 0,15 mililitra strzykawki do wstrzykiwań. Oddzielić strzykawkę do wstrzykiwań od rurki i ostrożnie wprowadzić tłok, uważając, aby powietrze nie dostało się do wnętrza strzykawki. Wcisnąć tłok, aż emulsja wyjdzie z igły i powtórzyć proces dla reszty emulsji znajdującej się w probówce.

Aby przeanalizować wielkość cząstek wody w oleju, dodaj niewielką kroplę emulsji do szkiełka mikroskopowego, rozsmaruj ją szkiełkiem nakrywkowym, a następnie mocno dociśnij okrężnymi ruchami, aby spłaszczyć emulsję.

Zbadaj rozmazaną emulsję pod mikroskopem z kontrastem fazowym o 400-krotnym powiększeniu i skup się na polu z monowarstwą emulsji. Upewnij się, że widoczne są małe, jednolite szare lub białe cząsteczki.