Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Mikroglej – makrofagi rezydujące w mózgu – eksprymują CD11b, integrynę na powierzchni komórki.

Aby wyizolować mikroglej z mózgów młodych myszy, należy pobrać fragmenty mózgu w probówkach dysocjacyjnych zawierających bufor z papainą, enzymem proteolitycznym i dezoksyrybonukleazą.

Umieść rurki na dysocjatorze mechanicznym. Podczas biegu dysocjator mechanicznie rozrywa tkankę.

Papaina trawi macierz zewnątrzkomórkową tkanki, uwalniając komórki, w tym mikroglej, do zawiesiny. Deoksyrybonukleaza rozkłada wolne DNA w zawiesinie, zapobiegając nieefektywnej izolacji komórek.

wirówka. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując. Przenieś zawiesinę przez sitko komórkowe w celu usunięcia zanieczyszczeń i grudek komórek i uzyskania jednorodnej populacji pojedynczych komórek.

Inkubować z mikrokulkami superparamagnetycznymi funkcjonalizowanymi przeciwciałami anty-CD11b. Mikrogranulki specyficznie wiążą się z CD11b na komórkach, w tym mikrogleju.

Po inkubacji, wirówka. Usunąć szwadron zawierający niezwiązane kulki. Ponownie zawieś komórki w buforze. Załadować na kolumnę umieszczoną na separatorze magnetycznym. Kolumna składa się z matrycy z kulkami ferromagnetycznymi.

Po umieszczeniu na separatorze, kulki wewnątrz kolumny wzmacniają pole magnetyczne, zatrzymując komórki CD11b+ związane z mikrokulkami w kolumnie, podczas gdy inne komórki przepływają przez nią.

Wyjmij z separatora i użyj buforu, aby wymyć komórki CD11b+ z kolumny. Odwirować zawiesinę i ponownie zawiesić komórki CD11b+ w pożywce dla mikrogleju.

Wyizolowane komórki są gotowe do dalszej analizy.

Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tą tabelą. Przenieś 12 kawałków mózgu do rurki C, co daje łączną wagę 1,2 grama na probówkę dysocjacyjną. Następnie umieść rurki C na dysocjatorze z ogrzewaniem. Uruchom zoptymalizowany program NTDK w dysocjatorze. Wirować przez 20 sekund. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy.

Przenieś komórki do czterech 15-mililitrowych probówek z dołączonymi sitkami. Przepłucz sitka 10 mililitrami HBSS z wapniem i magnezem. Wirować przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą 10-mililitrowej pipety. Ostrożnie dodaj 10 mililitrów HBSS z wapniem i magnezem i ponownie zawieś granulki. Ponownie odwirować i usunąć supernatant.

Ponownie zawiesić granulat za pomocą 6 mililitrów buforu sortującego. Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu mikrokulek CD11b i inkubuj probówki przez 15 do 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po inkubacji ponownie zawiesić osad z 6 mililitrami buforu sortującego. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad za pomocą 8 mililitrów buforu sortującego.

Następnie postępuj zgodnie z programem POSSEL na separatorze, aby przygotować osiem kolumn. Przepuść komórki przez kolumnę, dodając jednorazowo 1 mililitr zawiesiny komórek. Za pomocą 1 mililitra buforu sortującego eluować dodatnie komórki CD11b na sterylnej płytce elucyjnej. Połącz komórki w 50-mililitrowej probówce.

Odwirować i ponownie zawiesić osad z 10 mililitrami zimnego podłoża mikrogleju. Policz komórki dodatnie CD11b. Ponownie zawiesić komórki w zimnej pożywce mikrogleju, aby uzyskać końcowe stężenie od 650 000 do 700 000 komórek na mililitr.