Nanoiniekcja wirusa do klatki piersiowej w celu zbadania interakcji gospodarz-wirus u dorosłych much
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 wyświetleń • 3:52 min • July 8th, 2025
Weź znieczulonego samca Drosophila typu dzikiego i zmutowanego Dicer-2 na miskę iniekcyjną pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że muchy są wolne od wszelkich symbiotycznych bakterii, które hamują replikację wirusa RNA.
Zaszczepić muchy wewnątrz klatki piersiowej nanowstrzykiwaczem zawierającym jednoniciową zawiesinę wirusa RNA o dodatnim wykrywaniu.
Wirus wnika do komórki gospodarza poprzez endocytozę za pośrednictwem receptora i replikuje się, wytwarzając dwuniciowe pośrednie RNA. Receptor rozpoznawania wzorca gospodarza Dicer-2 przetwarza dwuniciowy RNA wirusa na małe interferujące RNA, siRNA.
SiRNA wiąże się z kompleksem wyciszającym indukowanym przez RNA, RISC, gdzie usuwana jest jego komplementarna nić. SiRNA załadowane RISC wiążą się z innymi wirusowymi RNA poprzez komplementarne parowanie zasad, powodując degradację wirusowego RNA i wyciszenie genów.
Interakcja Dicer-2 i wirusowego RNA aktywuje kaskady sygnalizacji przeciwwirusowej, wytwarzając białka przeciwwirusowe. Te białka przeciwwirusowe oddziałują z kinazą janusową lub JAK sąsiednich komórek gospodarza receptorami cytokin związanymi z białkami, inicjując dimeryzację receptorów i fosforylację JAK.
Aktywowane JAK fosforylują i aktywują białka STAT, przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji. Aktywowane STAT przemieszczają się do jądra i wiążą się ze specyficznymi sekwencjami DNA, inicjując transkrypcję genów odpowiedzi przeciwwirusowej.
Hoduj muchy przez pożądany okres.
Dalsza analiza wskazuje na zmniejszony wskaźnik przeżywalności i zwiększoną wiremię u zmutowanych muszek Dicer-2.
W przypadku infekcji wirusowej najpierw użyj mikroskopu stereoskopowego i cienkich kleszczyków, aby złamać końcówkę szklanej igły kapilarnej do odpowiedniej średnicy do nanoiniekcji. Aby zmontować wtryskiwacz, umieść O-ring uszczelniający i białą przekładkę na metalowym tłoku wtryskiwacza z dużym wgłębieniem skierowanym na zewnątrz.
Za pomocą strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 napełnić szklaną igłę olejem mineralnym i umieścić igłę przez kołnierz. Umieść większy O-ring wokół podstawy kołnierza, około 1 milimetra od końca igły i zamontuj igłę na tłoku wtryskiwacza.
Przymocować igłę do tłoka i nacisnąć pusty przycisk, aby wysunąć tłok mikrowstrzykiwacza, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy. Teraz naciśnij Wypełnij, aby cofnąć tłok na 5 milimetrów i zanurz igłę w zawiesinie wirusowej 100 jednostek tworzących płytkę nazębną. Delikatnie wstrząśnąć jedną lub co najmniej trzema fiolkami z 20 samcami Drosophila niezawierającymi Wolbachii na naczyniu do wstrzykiwań.
Preferowane są muchy obdarzone samcami, ponieważ zmienność hormonalna podczas krycia i reprodukcji może wpływać na odczyt z samicami.
Następnie wstrzyknij do klatki piersiowej każdej muchy 50,6 nanolitrów roztworu wirusa w nieco jaśniejszy obszar między mezopleurą a tetrapleurą i zmierz obciążenie DCV za pomocą testu efektu cytopatycznego i ilościowego RT-PCR od muszek naziemnych, jak właśnie pokazano. Po wstrzyknięciu należy ostrożnie przenieść muchy do świeżej fiolki i umieścić fiolkę w pozycji poziomej, aby zapobiec przywieraniu much do podłoża podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje odpowiedź przeciwwirusową u Drosophila, badając rolę białka Dicer-2 w przetwarzaniu wirusowego RNA. Praca podkreśla mechanizmy interferencji RNA oraz następującą po niej odpowiedź immunologiczną wywołaną infekcjami wirusowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Wirusologia
- Genetyka
Wstęp
- Dicer-2 jest kluczowym białkiem zaangażowanym w szlak interferencji RNA.
- Wirusy RNA mogą unikać mechanizmów obronnych gospodarza, co sprawia, że niezbędne są silne odpowiedzi przeciwwirusowe.
- Drosophila służy jako organizm modelowy do badania odporności wrodzonej.
- Zrozumienie tych mechanizmów może pomóc w opracowaniu szerszych strategii przeciwwirusowych.
Cel badania
- Wyjaśnienie roli Dicer-2 w mechanizmach obrony przeciwwirusowej.
- Ocena wpływu mutacji Dicer-2 na miano wirusa i wskaźniki przeżywalności.
- Zbadanie efektów efektora RNA interference w odpowiedziach immunologicznych gospodarza.
Zastosowane metody
- Inokulacja muszek *Drosophila* wirusem RNA o dodatnej polarności.
- Wykorzystanie nanowtryskiwacza do precyzyjnego dostarczania wirusa.
- Analiza degradacji wirusowego RNA oraz mechanizmów wyciszania genów.
- Ocena wskaźników przeżywalności i miana wirusa u much mutantów oraz typu dzikiego.
Główne wyniki
- Muchy z mutacją Dicer-2 wykazywały zwiększone miano wirusa w porównaniu do typu dzikiego.
- Wskaźniki przeżywalności były znacznie niższe u mutantów Dicer-2.
- U much typu dzikiego zaobserwowano aktywację przeciwwirusowych kaskad sygnalizacyjnych.
- Mechanizmy interferencji RNA zostały potwierdzone w analizach następczych.
Wnioski
- Dicer-2 odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi przeciwwirusowej u Drosophila.
- Mutacje w Dicer-2 upośledzają zdolność gospodarza do kontrolowania infekcji wirusowych.
- Wnioski z niniejszego badania mogą przyczynić się do zrozumienia mechanizmów przeciwwirusowych u innych organizmów.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna wewnątrzklatkowa nanoiniekcja wirusowa u Drosophila umożliwia kontrolowaną analizę oddziaływań gospodarz-wirus oraz aktywacji wrodzonych szlaków odpornościowych. Podejście to wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów dla szlaków odpowiedzi przeciwwirusowej, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji na wczesnym etapie tworzenia portfolio w badaniach nad chorobami zakaźnymi. Ilościowe wyniki uzyskane z tego modelu zwiększają pewność prognostyczną w odniesieniu do późniejszych badań translacyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie funkcji szlaków przeciwwirusowych poprzez perturbacje genetyczne i molekularne.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację wpływu konkretnych czynników gospodarza, takich jak Dicer-2.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla interferencji RNA oraz komponentów sygnalizacji JAK/STAT.
- Zapewnia ilościowe wyniki służące do selekcji projektów w portfelu w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia odtwarzalny system in vivo do oceny odpowiedzi gospodarza na wyzwanie wirusowe.
- Dostarcza zestandaryzowanych, ilościowych wyników za pomocą RT-PCR oraz testów efektu cytopatycznego.
- Umożliwia przygotowanie testu do przesiewania genetycznych lub farmakologicznych modulatorów szlaków przeciwwirusowych.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy do badań porównawczych między genotypami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla choroby mechanizmami odporności wrodzonej zachowanymi u różnych gatunków.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji celów przeciwwirusowych.
- Umożliwia postęp w badaniu ścieżek kandydackich z uwzględnieniem analizy ryzyka w oparciu o funkcjonalne dowody in vivo.
- Wspiera predykcyjne ograniczanie ryzyka w procesie opracowywania biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i walidacji przedklinicznej, łącząc badanie celów genetycznych z ilościowymi wynikami fenotypowymi.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów interakcji gospodarz-wirus oraz aktywacji szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne modele zakażeń do oceny efektów genetycznych lub działania związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące ładunku wirusowego i ekspresji genów w celu rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia dotyczące wrodzonych szlaków odpornościowych ze strategiami opracowywania preklinicznych biomarkerów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje wielokrotnie wykorzystywalną platformę in vivo do iteracyjnej walidacji celów i szlaków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów przeciwwirusowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w zakresie zakażania i analizy w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go oraz zwiększa efektywność kapitałową we wczesnych fazach badań nad lekami przeciwwirusowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i szlaków przeciwwirusowych do dalszego rozwoju w oparciu o analizę ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest wiedza z zakresu genetyki Drosophila oraz obchodzenia się z wirusami.
- Konieczny jest dostęp do aparatury do nanoiniekcji oraz infrastruktury do ilościowej PCR.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów infekcji i analizy pomiędzy zespołami.
- Możlizna może być konieczność adaptacji metody dla różnych szczepów wirusowych lub genotypów gospodarza.
- Ograniczenia praktyczne obejmują uwarunkowania organizmu modelowego oraz skalowalność przepustowości.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Zakażenie bakteryjne jamy ustnej i wydalanie u Drosophila melanogaster
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Allotransplantacja guza u Drosophila melanogaster za pomocą programowalnego wtryskiwacza Auto-Nanolitr
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Drosophila melanogaster (Drosophila melanogaster) Protokół wstrzyknięcia larw
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wstrzyknięcie dorosłych much Drosophila: metoda dostarczania związku lub etykiety
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Zakażenie much zawiesiną bakteryjną za pomocą nanowstrzykiwacza
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wirus wirusa grypy reporterowej lucyferazy-fluorescencji do śledzenia infekcji wirusowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Wykorzystanie modeli wirusa grypy pręgowanej u ludzi do badań przesiewowych leków przeciwwirusowych i scharakteryzowania odpowiedzi komórek odpornościowych gospodarza
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 29 sierpnia 2026