Ocena chemicznie wywołanego zapalenia jelita grubego za pomocą analizy immunohistochemicznej skrawków tkanki jelita grubego

U myszy warstwa błony śluzowej jelita grubego składa się z komórek odpornościowych zawierających blaszkę właściwą, otoczonych ciasno upakowanym nabłonkiem, który chroni błonę śluzową. Obróbka chemiczna siarczanem sodu dekstranu przerywa ścisłe połączenia, powodując uszkodzenie komórek nabłonka i umożliwiając drobnoustrojom luminalnym przenikanie do blaszki właściwej.

Rozpoznanie drobnoustrojów w jelicie grubym wyzwala wydzielanie chemokin, co prowadzi do infiltracji komórek odpornościowych i uwolnienia cytokin prozapalnych. Ta przesadna odpowiedź immunologiczna powoduje zapalenie jelita grubego lub zapalenie jelita grubego.

Aby ocenić zapalenie jelita grubego wywołane chemicznie, zacznij od szklanego szkiełka zawierającego stały, wstępnie potraktowany wycinek tkanki okrężnicy myszy wykazujący zapalenie jelita grubego wywołane chemicznie. Potraktuj sekcję koktajlem pierwszorzędowych przeciwciał specyficznych dla receptorów komórek odpornościowych, które wiążą się z odpowiednimi komórkami odpornościowymi.

Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał. Inkubować wycinek tkanki z biotynylowanymi przeciwciałami drugorzędowymi, które wiążą się specyficznie z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Inkubuj z koniugatami streptawidyna-enzym, które oddziałują z biotynami, tworząc kompleksy.

Pokryj wycinek tkanki substratem chromogennym; oddziaływanie enzym-substrat nadaje komórkom odpornościowym brązowe zabarwienie. Przeciwbarwić skrawek barwnikiem hematoksylinowym, aby zabarwić jądra komórkowe.

Obserwuj zabarwione szkiełko pod mikroskopem. Obfitość brązowych komórek odpornościowych w uszkodzonym obszarze wskazuje na zapalenie jelita grubego wywołane chemikaliami.

W przypadku analizy immunohistochemicznej, po podgrzaniu skrawków przez 20 minut na płycie grzejnej, umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 10 minut na mycie i wyeliminuj endogenną peroksydazę za pomocą 10-minutowej inkubacji 3% nadtlenku wodoru.

Pod koniec inkubacji przemyć próbki trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania buforem blokującym przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp bufor blokujący głównym koktajlem przeciwciał w celu inkubacji przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego ranka odessać nadmiar roztworu przeciwciał pierwotnych i umyć szkiełka trzy razy w PBS. Po ostatnim płukaniu inkubować szkiełka z odpowiednim biotynylowanym koktajlem przeciwciał drugorzędowych, a następnie znakować kompleksem peroksydazy chrzanowej streptawidyny w temperaturze pokojowej.

Aby uwidocznić komórki immunoreaktywne, oznacz próbki DAB, aż pojawi się jasnobrązowy lub ciemnobrązowy kolor i przeciwbarwij skrawki hematoksyliną i 0,3% rozcieńczonym amoniakiem.

Po wyschnięciu szkiełek użyj mikroskopu świetlnego, aby uzyskać obrazy w jasnym polu skrawków tkanek pod 10-krotnym powiększeniem i użyj programu do przetwarzania obrazu, aby zidentyfikować i określić ilościowo populację oznaczonych komórek odpornościowych zarówno w nabłonku, jak i blaszce właściwej.