Technika wytwarzania cząstek podobnych do wirusa grypy przez system ssaków

Cząsteczki wirusopodobne lub VLP naśladują strukturę wirusa, ale brakuje im materiału genetycznego wirusa, co czyni je niezjadliwymi. VLP posiadają związane z powierzchnią epitopy antygenowe rozpoznawane przez komórki odpornościowe, co czyni je idealnymi kandydatami na szczepionki.

Aby wygenerować rekombinowane VLP grypy, weź eukariotyczne wektory ekspresyjne.

Dwa wektory zawierają geny kodujące hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA) – białka strukturalne wirusa grypy. Trzeci wektor zawiera gen gag, kodujący białka rdzeniowe ludzkiego wirusa niedoboru odporności.

Dodać kationowy odczynnik do transfekcji na bazie lipidów. Dodatnio naładowana lipidowa grupa głowa oddziałuje z ujemnie naładowanym DNA, tworząc dwuwarstwę wokół wektorów - generując kompleksy transfekcji liposomów.

Dodaj kompleksy do hodowanych komórek gospodarza ssaków odpowiednich do produkcji VLP i inkubuj. Kompleksy transfekcyjne dostają się do komórek przez endocytozę - błona liposomowa łączy się z błoną endosomu, aby uwolnić wektory do cytoplazmy.

Wektory dostają się do jądra, prowadząc do ekspresji genów wirusa. Podczas syntezy HA i NA na retikulum endoplazmatycznym białka przemieszczają się do błony plazmatycznej przez szlak wydzielniczy.

Białka rdzeniowe są syntetyzowane w cytoplazmie i transportowane do miejsca montażu, aby zakotwiczyć się w błonie plazmatycznej. Nagromadzone składniki wirusa ulegają samoorganizacji w VLP i pączkują się z komórki gospodarza.

Zbierz zwolnione VLP do dalszego przetwarzania.

W dniu transfekcji należy przygotować roztwory liposomów i DNA zgodnie z zaleceniami producenta. Transfekować komórki DNA o składzie DNA 1:1:2 HA:NA:Gag i całkowitej ilości DNA 40 mikrogramów na kolbę T-150. Powtórz ten krok, aby utworzyć dziewięć kolb T-150 o łącznej objętości 200 mililitrów.

Następnie rozcieńczyć DNA i roztwory liposomów w pożywkach do transfekcji bez surowicy bez antybiotyków, tak aby każda kolba zawierała całkowitą objętość 24 mililitrów. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze i utrzymywać komórki w pożywce do hodowli transfekcyjnej do dnia zbioru cząstek wirusopodobnych lub VLP.

Przenieść supernatant do 15-mililitrowych stożkowych probówek w celu zebrania kultury z komórek po 72 do 96 godzinach po transfekcji. Zakręć komórkami w dół, aby granulować resztki komórkowe. Zebrać supernatanty i przefiltrować je przez membranę porową o średnicy 0,22 mikrona.