Name: Umieszczanie koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na zarodkach kurczaków we wczesnym stadium rozwoju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę umieszczania koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na zarodkach kurczaków w stadium E2,5. Ta technika in ovo pozwala badać wpływ czynników wzrostu na przeznaczenie komórek w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Wyjmij jaja z inkubatora
W stadium E2-2.5 (~ St. 17 HH) należy wyjąć jaja i odpowiednio je przygotować. Można przystąpić do pracy natychmiast lub zwrócić je do inkubatora na kilka godzin. Jaja można bezpiecznie przechowywać w temperaturze pokojowej przez ponad godzinę. Jaja mogą pozostać poza inkubatorem przez cały czas trwania manipulacji, które mogą czasami trwać godzinę lub dłużej.
Uwaga: Im dłużej pozostają w temperaturze pokojowej, tym mniejsza jest szansa na ich przeżycie.
2. Przygotowanie tuszu indyjskiego
<ol>
<li>Przygotować świeży roztwór 4% tuszu indyjskiego w sterylnym PBS.</li>
<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 3 mL przygotowanym roztworem.</li>
<li>Na strzykawkę nałożyć igłę o rozmiarze 27 gauge i długości ½ cala.</li>
<li>Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zgiąć igłę pod kątem 90°.</li>
</ol>
3. Otwieranie jaj i wstrzykiwanie tuszu indyjskiego
<ol>
<li>Za pomocą pęsety odkleić taśmę i otworzyć okno, mocując je przy pomocy drugiej strony taśmy na tylnej części jaja.</li>
<li>Wprowadzić igłę pod kątem, aż znajdzie się ona tuż pod embrionem. Umieszczenie igły pod tarczą zarodkową gwarantuje, że tusz, który jest toksyczny dla embrionu, nie wejdzie z nim w bezpośredni kontakt.</li>
<li>Należy wstrzyknąć tylko tyle tuszu, aby uzyskać odpowiedni kontrast. Zazwyczaj jest to mniej niż ¼ mL.</li>
</ol>
4. Otwieranie rurki nerwowej
<ol>
<li>Za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych przetnij cienką błonę znajdującą się na powierzchni lub wokół zarodka.</li>
<li>Używając pęsety nr 55 lub sondy wolframowej, otwórz rurkę neuronalną w kierunku od tylnego do przedniego końca. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby można było w nim umieścić kuleczkę.</li>
</ol>
Uwaga: W zależności od wieku można użyć cienkiej sondy wolframowej w celu uzyskania tego samego efektu.
5. Odzyskiwanie powlekanych kulek heparynowo-akrylowych
<ol>
<li>Za pomocą pęsety 55 odnaleźć w roztworze nienaruszoną kuleczkę. Pozwolić kuleczce przywrzeć do końcówki i powoli zamknąć pęsetę.</li>
<li>Wyjąć kuleczkę z roztworu i przenieść ją nad jajo.</li>
<li>Po wyjęciu z roztworu kuleczka prawdopodobnie nie oddzieli się od pęsety, dopóki nie zostanie umieszczona w albuminie.</li>
</ol>
6. Umieszczenie kulek
<ol>
<li>Po umieszczeniu kuleczki na obszarze docelowym, należy za pomocą sondy wolframowej skierować ją w stronę przedmózgowia lub przymocować w tylnomózgowiu.</li>
<li>Dodaj kilka kropel PBS za pomocą pipety 10 µL.</li>
</ol>
7. Zamykanie jaja
<ol>
<li>Zamknij jajo, używając cienkiego kawałka taśmy, aby zatkać okienko.</li>
<li>Uszczelnij jajo zgodnie z protokołem przygotowawczym, dostępnym&nbsp;pod adresem <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a>.</li>
</ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W zależności od białka, którego chcą Państwo użyć, istnieją różne protokoły przygotowania kulek. W niniejszych eksperymentach stosujemy kulki heparynowo-akrylowe, lecz można również użyć kulek affi-gel. Stwierdziliśmy, że kulki heparynowo-akrylowe są łatwiejsze w manipulacji w środowisku wodnym albuminy jaja. Kulki namaczamy w 5 µl białka przez noc w temperaturze 4°C. Kulki kontrolne umieszcza się w sterylnym PBS aż do momentu aplikacji. Zaletą przygotowania in ovo jest fakt, że zarodek pozostaje żywy i może rozwijać się...

<table><tbody><tr><td>Jaja</td><td>Zwierzę</td><td></td><td></td><td>Zapłodnione, E2-2,5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tusz indyjski</td><td>Narzędzie</td><td>Higgins</td><td></td><td>Przygotować 4% roztwór w sterylnym PBS.</td></tr><tr><td>Sterylny PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternatywnie można zastosować koktajl przeciwciał</td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły 27G 1/2</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Ustawione pod kątem 90 stopni</td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>rozmiar 55</td></tr><tr><td>Kleszczyki hemostatyczne</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do sekcji</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>Vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Taśma Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>do uszczelniania jaj</td></tr><tr><td>Sonda wolframowa</td><td>Narzędzie</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Narzędzie nr 24. Uchwyt opcjonalny.</td></tr></tbody></table>

umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Przewód nerwowy wykazuje ekspresję wielu białek w specyficznych wzorcach czasoprzestrzennych podczas rozwoju. Wykazano, że białka te mają krytyczne znaczenie dla determinacji losu komórek, migracji komórkowej oraz tworzenia obwodów neuronalnych. Indukcja i wzorowanie neuronalne obejmują między innymi białko morfogenetyczne kości (BMP), sonic hedgehog (SHH) oraz czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). W szczególności wzorzec ekspresji Fgf8 występuje w bliskim sąsiedztwie regionów wykazujących ekspresję BMP4 i SHH. Wzorzec ten jest zgodny z interakcjami rozwojowymi, które ułatwiają wzorowanie w telencefalonie.

W niniejszym materiale przedstawiamy wizualną demonstrację metody, w której preparat in ovo może zostać wykorzystany do zbadania wpływu Fgfs na formowanie się przedmózgowia. Kuleczki są pokrywane białkiem i umieszczane w rozwijającej się rurce neuralnej w celu zapewnienia długotrwałej ekspozycji. Ponieważ procedura wykorzystuje małe, precyzyjnie rozmieszczone kuleczki, jest ona małoinwazyjna i pozwala na umieszczenie kilku kuleczek w obrębie jednej rurki neuralnej. Ponadto metoda ta umożliwia dalszy rozwój, dzięki czemu embriony mogą być analizowane na bardziej dojrzałym etapie w celu wykrycia zmian w anatomii i wzorowaniu neuronalnym. Ten prosty, lecz użyteczny protokół umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym. Stanowi on sposób na wprowadzanie ograniczonych przestrzennie i czasowo zmian w endogennych poziomach białek.

Różnorodne czynniki wzrostu i białka oddziałują na siebie, indukując komórki do przyjmowania różnych przeznaczeń komórkowych podczas rozwoju. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie preparacji in ovo w celu zbadania możliwych oddziaływań między różnymi białkami w rozwoju, poprzez umieszczanie kulek w embrionach kurzych w stadium E2.5.

Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Cewka neuronalna wykazuje ekspresję wielu białek w specyficznych wzorcach czasowo-przestrzennych podczas rozwoju. Wykazano, że białka te są kluczowe dla komórek...

Witamy w laboratorium Raburna. Jestem Matt Korn z wydziału Neurobiologii i Zachowania na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj weźmiemy jajo, otworzymy je i umieścimy wewnątrz kuleczkę nasączoną czynnikiem wzrostu.Właściwe przygotowanie jaja pozwoli nam wprowadzić czynnik wzrostu, aby zmienić przeznaczenie kilku różnych typów tkanek na tym wczesnym etapie rozwoju embrionalnego. Dzień drugi i pół, czyli stadium 17. Dobrze, znajdujemy się teraz przy mikroskopie.Przygotowałem jaja i wszystkie narzędzia. Zatem proszę, wyjmijcie jedno jajo – tutaj widać, gdzie znajduje się nasza taśma. Uszczelnienie okna.Mam tutaj taki ładny mały pączek. Jest on wykonany z gliny artystycznej, którą można kupić w sklepie plastycznym. I teraz wezmę parę bardzo słabej jakości pęset.Są one dostępne od dawna. Końcówki są dość tępe, ale świetnie sprawdzają się do delikatnego podważenia taśmy, aby okno mogło się podnieść. Mogę je teraz odłożyć.Złożę to teraz i wsunę jajo, tak aby to okienko znalazło się z tyłu. Teraz mogę umieścić je pod mikroskopem i przeprowadzić dowolne manipulacje. W tym przypadku będziemy wprowadzać kuleczki, więc teraz sięgnę po tusz indyjski, bez tuszu indyjskiego.Można zauważyć, że tutaj znajduje się tarcza zarodkowa, przesunięta nieco na bok. Jeśli obrócę jajo, zobaczę miejsce, w którym krew tworzy tutaj okrąg. Następnie mogę przygotować igłę z tuszem indyjskim.Teraz przesunę się na bok, zajrzę pod krążek, gdzie znajduje się embrion. Nie chcę go przesuwać zbyt mocno, aby zachować kontrast embrionu na czarnym tle. Następnie obrócę go tak, aby część rostralna embrionu była skierowana do przodu.A tutaj widać obszar głowy. Tutaj przebiega cewka nerwowa, a widoczne są również somity, które pozwalają nam określić wiek zarodka. Po przybliżeniu obrazu można zauważyć, że serce bije bardzo powoli, ale rytmicznie, co jest dobrym znakiem.Serce było obecne, lecz nie biło. Musielibyśmy zastanowić się, czy jest to próbka żywa. Ponieważ nie ma nad nim wyraźnej grubej błony, mogę przejść bezpośrednio do użycia sondy wolframowej.Po pierwsze, znajduje się tutaj cienka błona, którą odsunę, aby uzyskać dostęp do zarodka. Umieszczamy kuleczki zarówno w przedmózgowiu, jak i w rzódmózgowiu. Tym razem będę celować w przedmózgowie.Teraz, aby się tam dostać, muszę przeciąć błonę. W przypadku młodszych osobników mogę po prostu użyć sondy wolframowej, aby dostać się przez cewkę neuralną, co zapewni mi dostęp do obszaru, w którym chcę umieścić koralik. Przechodzę zatem do użycia mojej sondy wolframowej.Używam obu rąk, aby ustabilizować dłoń. Przystąpię teraz do manipulowania zarodkiem. Gdy wprowadzę już kuleczkę, będę mógł umieścić ją bezpośrednio w rurce neuronowej, aż do przedmózgowia.Dobrze, teraz gdy zarodek jest otwarty, mogę przystąpić do jego przygotowania i umieszczenia kuleczki. W tym celu wprowadzę sondę nieco głębiej i otworzę rurkę neuralną, co możecie zobaczyć na ekranie. Teraz przybliżę obraz nieco bardziej.Zmieniam tutaj nieco ostrość. Można zauważyć, że znajduje się tam ładny otwór, jednak nie wykonałem otworu nad miejscem, gdzie znajduje się cephalon ogona, ponieważ to właśnie tam zostanie umieszczona kuleczka. Nie chcę zatem otworu, przez który kuleczka mogłaby wypłynąć.Chcę go nieco cofnąć, aby móc włożyć kuleczkę i przesunąć ją do przodu. Teraz wezmę kuleczkę. Jak widać, dostępne są różne rozmiary.Są to akryle z heparyną, znajdują się w PBS. Teraz wezmę pęsetę 55. Jak widać, zanurzam ją w PBS i wybieram odpowiedni element.A gdy zostanie wyjęte z PBS, zazwyczaj przylega do pęsety, co można tutaj zauważyć. Teraz należy przykryć kuleczki. Odzyskuję moją komórkę jajową.Ustawię ostrość na jajeczko. Teraz wezmę koralik za pomocą pęsety 55. Znajduje się on nieco wyżej na pęsecie, niż bym chciał, ale tutaj jest.Teraz po prostu naprowadzę go w miejsce, w którym wykonałem otwór w rurce nerwowej. Gdy tylko znajdzie się on w rurce nerwowej, manipulowanie nim w kierunku przedniej części rozwijającego się mózgu staje się łatwiejsze. Zatem użyję teraz sondy wolframowej i po prostu go pchnę.Podczas umieszczania kuleczki w części głowowej (cephalon) należy zachować ostrożność, ponieważ w miarę rozwoju embrionu zaczyna on wyginać się do przodu, a następnie na bok. Często zdarza się, że podczas wprowadzania kuleczki do przedmózgowia w obrębie cephalon, kuleczka przesuwa się w stronę dzioba, ponieważ dziób tworzy się na części brzusznej embrionu, podczas gdy mózg znajduje się w regionie grzbietowym. Jednak ten wynik wygląda dość dobrze.Jestem całkiem zadowolony z efektu. Teraz wezmę pipetę z 10 µL sterylnego PBS i naniosę tutaj kilka kropel. Dobrze, teraz możemy zamknąć jajo.Teraz po prostu przesunę okienko tutaj, do góry i w bok; jajko nie jest jeszcze szczelnie zamknięte. Aby zapobiec jego wysychaniu, użyję kawałka tej plastikowej taśmy, której używaliśmy, i odetnę fragment. Powinien on mieć rozmiar nieco większy niż okienko.Lekko go rozciągnę, a następnie umieszczę dokładnie nad tym otworem i upewnię się, że przylega on ściśle. Dzięki temu wszystkie otwory, które wykonaliśmy – zarówno podczas odprowadzania albuminy, jak i wycinania okienka – zostaną uszczelnione. W ten sposób jajko jest teraz szczelne, nie może stracić żadnej albuminy i nie wyschnie.Powinno ono rozwijać się normalnie. To wszystko w kwestii umieszczenia kuleczek. Powodzenia w eksperymentach na pisklętach; mam nadzieję, że uzyskacie pożądane wyniki.

placing-growth-factor-coated-beads-on-early-stage-chicken-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Umieszczanie koralików powlekanych czynnikiem wzrostu na wczesnym etapie zarodków kurcząt

W niniejszym filmie zaprezentowano dwie metody przygotowania i umieszczania kuleczek pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantach rozwijającej się kory mózgu. Kuleczki te mogą być wykorzystywane do indukcji przestrzennie ograniczonej ekspresji genów w rozwijającej się tkance nerwowej, takiej jak eksplanty przedmózgowia. Przedstawiono metody wykorzystujące zarówno kuleczki Affi-Gel, jak i akrylowe kuleczki heparynowe.

Umieszczanie kuleczek pokrytych czynnikami wzrostu w eksplantach grzbietowej części przedmózgowia

W tym filmie zaprezentowano New culture – metodę, dzięki której zarodki kurcząt są hodowane poza jajem przez maksymalnie 24 hr. Metoda ta umożliwia badanie wczesnego rozwoju (od pręgi pierwotnej do 14 som.), co odpowiada okresowi E7-9 u myszy. Zastosowania tej techniki obejmują elektroporację, hybrydyzację in situ oraz immunohistochemię.

Metoda hodowli wczesnych zarodków kurczaka ex vivo (nowa hodowla)

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Opisano podejście do analizy migracji i ostatecznego losu ptasich komórek grzebienia neuronalnego w embrionach chimerycznych przepiórnik-kurczak. Metoda ta stanowi prostą i przejrzystą technikę śledzenia komórek grzebienia neuronalnego podczas migracji i różnicowania, których w przeciwnym razie trudno byłoby odróżnić w niezmodyfikowanym embrionie kurczaka.

Analiza migracji i różnicowania grzebienia neuronalnego za pomocą transplantacji międzygatunkowej

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.

Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Poprzez szczepienie koralików nasączonych czynnikami wzrostu lub specyficznymi inhibitorami szlaków sygnałowych do rozwijających się zarodków, możliwe jest bezpośrednie testowanie ich efektów in vivo. W tym protokole kulki są szczepione w zawiązku kończyny w celu określenia wpływu tych cząsteczek na ekspresję genów i transdukcję sygnału.

Szczepienie kulek w rozwijających się kończynach zarodka kurczaka w celu identyfikacji szlaków transdukcji sygnału wpływających na ekspresję genów

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

W tej metodzie, embrionalne tkanki serca są chirurgicznie mikropreparowane, dysocjowane, znakowane fluorescencyjnie i wszczepiane do tkanek embrionalnych gospodarza. Stanowi to platformę do badania indywidualnej lub tkankowej organizacji rozwoju w ektopowych warunkach hemodynamicznych i/lub zmienionym środowisku parakrynnym/juktakrynowym.

System mikroiniekcji do implantacji in vivo kardiomiocytów zarodkowych w zarodku ptaków

Test nasiąkniętych kulek polega na ukierunkowanym dostarczeniu odczynnika testowego w dowolnym momencie rozwoju w celu zbadania regulacji różnicowania i morfogenezy komórek. Przedstawiono szczegółowy protokół, mający zastosowanie do każdego doświadczalnego modelu zwierzęcego, dotyczący przygotowania trzech różnych rodzajów namoczonych koralików i wszczepienia ich w komórkę międzypalcową zarodka kurczaka.

Analiza różnicowania komórek, morfogenezy i wzorcowania podczas embriogenezy kurczaka przy użyciu testu z namoczonymi kulkami

Poznaj metodę umieszczania koralików pokrytych czynnikiem wzrostu na zarodkach kurczaków w stadium E2,5. Ta technika in ovo pozwala badać wpływ czynników wzrostu na przeznaczenie komórek w biologii rozwoju.

Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Przeglądaj więcej filmów