Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych w celu zbadania aktywności proteolitycznej proteaz

Wirusy otoczkowe z transbłonowymi białkami kolców zawierają proteolityczne miejsce rozszczepienia.

Proteazy związane z błoną na komórkach gospodarza rozszczepiają białka kolców, odsłaniając peptydy fuzyjne, które ułatwiają wnikanie wirusa.

Na początek weź peptydy typu dzikiego z kanonicznym miejscem rozszczepienia i peptydami wariantowymi, z których każdy ma unikalną mutację w tym miejscu.

Peptydy fluorogenne zawierają fluorofor i wygaszacz. Ze względu na bliskość wygaszacz absorbuje fluorescencję fluoroforu.

Pobrać wielodołkową płytkę na lodzie, zawierającą bufor testowy i proteazy gospodarza.

Dodaj peptydy typu dzikiego i wariantowego do oddzielnych studzienek. Inkubować w odpowiedniej temperaturze, aby uzyskać optymalną aktywność proteazy.

Proteaza rozszczepia peptydy, oddzielając wygaszacz od fluoroforu i umożliwiając jego emisję fluorescencji.

Zmierz zmianę sygnału fluorescencji, aby określić szybkość rozszczepienia proteolitycznego.

Wyższy wskaźnik dla sekwencji typu dzikiego wskazuje na wyższą aktywność proteolityczną, podczas gdy niższy wskaźnik dla wariantów wskazuje na zmienioną wydajność rozszczepienia.

Przygotować odpowiednie testowe dla proteaz zgodnie z opisem w proto