Monitorowanie przybycia białek powierzchniowych znakowanych GFP do sieci trans-Golgiego przy użyciu funkcjonalizowanych nanociał

Zacznij od komórek rakowych pozbawionych siarczanów, które wyrażają białko powierzchniowe znakowane GFP.

Dodać znakowany radioaktywnie siarczan i zmodyfikowane nanociała anty-GFP - jednołańcuchowe przeciwciało niosące motyw siarczanu tyrozyny i inkubować.

Komórki pozbawione siarczanów internalizują znakowane radioaktywnie siarczany, włączając je do składników komórkowych.

Nano anty-GFP wiąże się z białkiem powierzchniowym znakowanym GFP i zostaje endocytoza do pęcherzyka. Pęcherzyk ten transportuje kompleks białkowy nanociało-powierzchnia wzdłuż określonych szlaków wewnątrzkomórkowych, w tym sieci trans-Golgiego lub TGN.

W obrębie TGN sulfotransferaza w obecności substratu przenosi radioaktywny siarczan do określonych reszt tyrozyny na nanociele, znakując je w ten sposób radioznakując.

Umyj komórki. Następnie poddaj komórki lizie.

Odwiruj lizat, aby usunąć duże zanieczyszczenia komórkowe. Wyizoluj nanociała za pomocą metody oczyszczania na bazie kulek niklu.

Załaduj wyizolowaną frakcję na żel SDS-PAGE, aby rozdzielić znakowaną radioaktywnie nanocząsteczkę na odrębne pasma.

Poddaj żel autoradiografii.

Uzyskany autoradiogram ujawnia pociemniałe obszary, wskazując na obecność znakowan