Wykorzystanie fluorescencji immuno-RNA Hybrydyzacja in Situ do wizualizacji SARS-CoV-2

Weźmy utrwalone i przepuszczalne komórki Vero zakażone koronawirusem - linię komórkową ssaków z niedoborem interferonu.

Wewnątrz gospodarza wirusowe RNA jest obecne w postaci subgenomowych lub sgRNA, cząsteczek RNA o średniej długości kodujących określone białka wirusowe syntetyzowane przez transkrypcję.

Dodaj sondy reakcji łańcuchowej hybrydyzacji lub sondy inicjujące HCR.

Sonda HCR wiąże się ze swoją komplementarną sekwencją na docelowym RNA.

Wprowadź fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydowe sondy do włosów, H-1 i H-2.

Sonda inicjująca wiąże się ze swoim komplementarnym ogonem H1, linearyzując strukturę spinki do włosów.

Odsłonięta sekwencja H1 wiąże się z komplementarnym ogonem H2.

Ciągnąca się sekwencja H2 kontynuuje wiązanie się z ogonem H1, wzmacniając sondy znakowane fluorescencyjnie wokół obszaru docelowego i generując silny sygnał.

Dodaj odpowiednie przeciwciała, aby uwidocznić cytoszkielet komórki gospodarza.

Wybarwić jądra za pomocą DAPI.

Pod mikroskopem fluorescencyjnym komórki zakażone wirusem wykazują czerwoną fluorescencję w cytoplazmie, wskazując na obecność docelowego RNA.

Po utrwaleniu i przepuszczalności komórek, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym, usuń 1x roztwór PBS ze studzienek i dodaj co najmniej 300 mikrolitrów buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki. Próbki należy inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj każdą spinkę do włosów HCR, schładzając zatrzaskowo żądaną objętość w oddzielnych probówkach.

Aby przygotować 300 mikrolitrów roztworu wzmacniającego, użyj 18 pikamoli z każdej spinki do włosów. Przenieś roztwór spinki do włosów do probówek i inkubuj je w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 90 sekund. Następnie schładzaj do temperatury pokojowej przez 30 minut w ciemności. Przygotuj mieszankę spinek do włosów, dodając chłodzone zatrzaskowo spinki H1 i H2 do buforu wzmacniającego. Umieść krople od 30 do 50 mikrolitrów mieszanki spinek do włosów na parafilmie i inkubuj próbki przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.

Aby zamontować szkiełka, umieść dwie 10-mikrolitrowe krople podłoża montażowego na szkiełku, upewniając się, że krople są wystarczająco oddzielone, aby umożliwić umieszczenie dwóch szkiełek nakrywkowych na jednym szkiełku. Usuń nadmiar płynu, stukając w szkiełka nakrywkowe o czysty ręcznik. Następnie umieść je w podłożu montażowym zapobiegającym blaknięciu, komórkami skierowanymi w dół. Umieść zamontowane próbki na suchej, płaskiej powierzchni w ciemności i pozwól im się utwardzić.