Pomiar alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej mysie komórki dendrytyczne lub DC przenoszące alloantygeny lub warianty genetyczne własnych antygenów.

Wprowadź mysie limfocyty T, w tym alloreaktywne limfocyty T, które nie reagują na własne antygeny, jednocześnie rozpoznając obce antygeny.

Alloreaktywne limfocyty T rozpoznają te alloantygeny i oddziałują z DC, wywołując rearanżację cytoszkieletu, w tym reorganizację F-aktyny.

To skłania receptory na limfocytach T do angażowania się w cząsteczki kostymulujące na DC, tworząc połączenie komórkowe - synapsę immunologiczną.

Napraw komórki, przenieś je do probówki i wprowadź koktajl przeciwciał znakowanych fluorochromem specyficznych dla limfocytów T i receptorów DC, nadając wyraźną fluorescencję.

Usuń niezwiązane przeciwciała i ponownie zawieś komórki w buforze zawierającym czynnik permeabilizujący, który przenika komórki i zielone markery białkowe znakowane fluoroforem, które wiążą się z F-aktyną.

Odwirować i ponownie zawiesić komórki w buforze zawierającym barwnik jądrowy, barwiąc jądra na czerwono.

Korzystając z obrazowej cytometrii przepływowej, zidentyfikuj dublety - odpowiadające koniugatom limfocytów T i DC z zielonym krzyżykiem F-ak