Pomiar alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T

Zacznij od płytki wielodołkowej zawierającej mysie komórki dendrytyczne lub DC przenoszące alloantygeny lub warianty genetyczne własnych antygenów.

Wprowadź mysie limfocyty T, w tym alloreaktywne limfocyty T, które nie reagują na własne antygeny, jednocześnie rozpoznając obce antygeny.

Alloreaktywne limfocyty T rozpoznają te alloantygeny i oddziałują z DC, wywołując rearanżację cytoszkieletu, w tym reorganizację F-aktyny.

To skłania receptory na limfocytach T do angażowania się w cząsteczki kostymulujące na DC, tworząc połączenie komórkowe - synapsę immunologiczną.

Napraw komórki, przenieś je do probówki i wprowadź koktajl przeciwciał znakowanych fluorochromem specyficznych dla limfocytów T i receptorów DC, nadając wyraźną fluorescencję.

Usuń niezwiązane przeciwciała i ponownie zawieś komórki w buforze zawierającym czynnik permeabilizujący, który przenika komórki i zielone markery białkowe znakowane fluoroforem, które wiążą się z F-aktyną.

Odwirować i ponownie zawiesić komórki w buforze zawierającym barwnik jądrowy, barwiąc jądra na czerwono.

Korzystając z obrazowej cytometrii przepływowej, zidentyfikuj dublety - odpowiadające koniugatom limfocytów T i DC z zielonym krzyżykiem F-aktyny - potwierdzające tworzenie synaps.

Określ ilościowo dublety reprezentujące stopień alloreaktywności.

Zacznij od wysiewu 0,5 razy 10 do szóstych komórek dendrytycznych do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórek, a następnie 1 razy 10 do szóstej limfocytów T w końcowej objętości do 50 mikrolitrów pożywki hodowlanej na basenik. Inkubuj zimne kultury przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnie dodaj trzykrotność objętości kultury 1,5% formaldehydu w PBS do każdej studzienki przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec utrwalania przenieść komórki z każdej studzienki do odpowiedniej 5-mililitrowej rurki polistyrenowej i wybarwić komórki odpowiednimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem w 100 mikrolitrach buforu do przemywania przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.

Następnie umyj komórki w 1 mililitrze buforu do przemywania i ponownie zawieś granulki w trwałym buforze do płukania zawierającym falloidynę-FITC. Po kolejnych 30 minutach w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem umyj komórki w 1 mililitrze świeżego buforu do trwałej ondulacji. Ponownie zawiesić granulki w interesującym nas barwniku jądrowym w buforze do płukania trwałej ondulacji na końcową 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem i umyć komórki w 1 mililitrze buforu do płukania po trwałej ondulacji, a następnie przeprowadzić jedno płukanie w samym buforze do mycia. Następnie ponownie zawieś komórki w 50 do 100 mikrolitrach świeżego buforu do płukania i przenieś komórki do probówek do mikrowirówek o małej nasadce.

Aby przeanalizować interakcje międzykomórkowe, najpierw zarezerwuj jeden kanał do akwizycji obrazu w jasnym polu i załaduj pierwszą rurkę kontrolną. Przy wyłączonym kanale jasnego pola w oknie Przestrzeń robocza utwórz nowy wykres rozrzutu dla każdego kanału używanego ze współczynnikiem proporcji dla danego obszaru i przebramuj pojedyncze elementy, w których współczynnik proporcji jest bliski jeden.

Dla każdego fluorochromu sprawdź populację dodatnią i w razie potrzeby dostosuj napięcie lasera w skrzynce oświetleniowej. W polu Kanały wybierz odpowiednie kanały dla fluorochromów użytych w barwieniu. Następnie kliknij przycisk Nagraj. Gdy liczba zdarzeń osiągnie określony próg, akwizycja zostanie automatycznie zatrzymana.

Po uzyskaniu wszystkich pojedynczych kontroli barwienia, załaduj pierwszą eksperymentalną probówkę z próbką i uzyskaj kilkadziesiąt tysięcy zdarzeń w odpowiednich kanałach analizy, w tym w kanale jasnego pola.