Test uwalniania barwnika w celu ilościowego określenia aktywności enzymatycznej białek przeciwdrobnoustrojowych

Zacznij od probówki zawierającej zabitą termicznie zawiesinę bakteryjną i potraktuj roztworem barwnika.

Cząsteczki barwnika kowalencyjnie wiążą się z peptydoglikanem - niezbędnym składnikiem ściany komórkowej bakterii, nadając jej niebieskie zabarwienie.

Osadzać bakterie i usuwać supernatant zawierający niezwiązane cząsteczki barwnika.

Ponownie zawiesić bakterie i wprowadzić przeciwdrobnoustrojowy roztwór białka do probówki, wywołując enzymatyczną hydrolizę bakteryjnego peptydoglikanu, co powoduje degradację ściany komórkowej, a następnie lizę komórki.

Prowadzi to do uwolnienia cząsteczek barwnika, nadając mu niebieskie zabarwienie.

Dodać etanol — środek denaturujący białka, dezaktywujący białka przeciwdrobnoustrojowe i kończący reakcję enzymatyczną.

Odwirować zawartość, aby osadzać fragmenty komórek i enzymy. Przenieść supernatant zawierający cząsteczkę barwnika na płytkę wielodołkową.

Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję przy 595 nanometrach.

Porównaj absorbancję próbki poddanej działaniu enzymu z absorbancją próbki niepoddanej działaniu enzymu, aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną białka przeciwdrobnoustrojowego.

W teście uwalniania barwnika substrat jest kowalencyjnie połączony z barwnikiem Remazol Brilliant Blue R lub RBB. Rozpocznij ten protokół od wykonania 200-milimolowego roztworu RBB. Rozpuść 1,25 grama RBB w świeżo przygotowanym roztworze wodorotlenku sodu.

Następnie ponownie zawieś zabite termicznie komórki bakteryjne w stężeniu 0,5 grama mokrej masy w 30 mililitrach roztworu RBB. W przypadku oczyszczonego peptydoglikanu należy ponownie zawiesić peptydoglikan w stężeniu 0,3 grama mokrej masy i 30 mililitrach roztworu RBB.

Ponieważ kolejne etapy są takie same niezależnie od użytego substratu, oznakowanie zostanie zademonstrowane tylko dla komórek bakteryjnych. Mieszaninę reakcyjną inkubować na obrotowej platformie przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po sześciu godzinach przenieś mieszaninę reakcyjną do inkubatora o temperaturze 4 stopni Celsjusza i inkubuj przez dodatkowe 12 godzin z delikatnym mieszaniem.

Po zakończeniu inkubacji należy zebrać barwiony substrat przez odwirowanie w ilości 3 000 g przez 30 minut. Zdekantować roztwór barwnika z osadu substratu. Dokładnie zawiesić osad w wodzie typu 1, a następnie odwirować. Umyj komórki znakowane barwnikiem trzy do pięciu razy w ten sposób, aby usunąć niekowalencyjnie połączony rozpuszczalny barwnik z substratów.

W celu końcowego prania przenieś porcję granulek, która zostanie użyta w teście uwalniania barwnika, do 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge. Supernatant z ostatniego prania powinien być klarowny, podczas gdy podłoże pozostaje niebieskie. Barwione podłoże należy przechowywać zawieszone w minimalnej ilości wody o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowe do użycia.

Aby przygotować się do testu uwalniania barwnika, pozwól, aby zamrożony barwiony substrat powrócił do temperatury pokojowej i przemyj dwukrotnie buforem testowym, który został empirycznie określony dla enzymu. W tym przypadku używany jest PBS. Obliczyć objętość zawiesiny substratu, która jest potrzebna, mnożąc objętość reakcji o pojemności 200 mikrolitrów przez liczbę testów uwalniania barwnika, które należy przeprowadzić.

W celu przygotowania zawiesiny substratu należy najpierw dodać barwione podłoże do odpowiedniej objętości PBS. Wykonaj rozcieńczenie jeden do jednego i wykonaj wstępny pomiar gęstości optycznej przy 595 nanometrach, używając PBS jako ślepej próby. Dodawać przyrostowe ilości barwionego podłoża do zawiesiny, aż do uzyskania gęstości optycznej 2,0 przy 595 nanometrach.

W tej demonstracji test uwalniania barwnika zostanie wykorzystany do określenia optymalnych warunków inkubacji białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego. Najpierw należy przygotować podstawową zawiesinę przeciwdrobnoustrojową białka, dostosowując stężenie do 1 miligrama na mililitr za pomocą PBS, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Następnie rozcieńczyć podstawową zawiesinę przeciwdrobnoustrojową białka do stężenia 100 nanogramów na mikrolitr.

Stężenie to daje końcową masę reakcyjną wynoszącą 1 mikrogram białka na objętość dodanego do reakcji testu. Wykonaj testy reakcji w 0,5-mililitrowych probówkach do mikrofug dla ocenianego zakresu termicznego. Dla każdego warunku termicznego dodać 10 mikrolitrów białka podstawowego do 200 mikrolitrów przygotowanej zawiesiny substratu.

Inkubować w termocyklerze przez osiem godzin z mieszaniem przez inwersję raz na godzinę. Po inkubacji zatrzymaj reakcje, dodając 25 mikrolitrów etanolu do każdej probówki do mikrofuge. Aby usunąć niestrawiony nierozpuszczalny substrat, odwirować z prędkością 3000 g przez dwie minuty. Następnie, uważając, aby nie zakłócić osadu niestrawionego substratu, przenieś 150 mikrolitrów supernatantu reakcyjnego dla każdej mieszaniny reakcyjnej na 96-dołkową mikropłytkę płaskodenną.

Aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną, użyj spektrofotometru z mikropłytkami, aby zmierzyć absorbancję supernatantu przy 595 nanometrach. Zwiększona absorbancja przez rozpuszczalny barwnik uwalniany do supernatantu ze znakowanego substratu jest ilościowym pomiarem aktywności enzymatycznej.