Test uwalniania barwnika w celu ilościowego określenia aktywności enzymatycznej białek przeciwdrobnoustrojowych
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 6:01 min. • July 8th, 2025
Zacznij od probówki zawierającej zabitą termicznie zawiesinę bakteryjną i potraktuj roztworem barwnika.
Cząsteczki barwnika kowalencyjnie wiążą się z peptydoglikanem - niezbędnym składnikiem ściany komórkowej bakterii, nadając jej niebieskie zabarwienie.
Osadzać bakterie i usuwać supernatant zawierający niezwiązane cząsteczki barwnika.
Ponownie zawiesić bakterie i wprowadzić przeciwdrobnoustrojowy roztwór białka do probówki, wywołując enzymatyczną hydrolizę bakteryjnego peptydoglikanu, co powoduje degradację ściany komórkowej, a następnie lizę komórki.
Prowadzi to do uwolnienia cząsteczek barwnika, nadając mu niebieskie zabarwienie.
Dodać etanol — środek denaturujący białka, dezaktywujący białka przeciwdrobnoustrojowe i kończący reakcję enzymatyczną.
Odwirować zawartość, aby osadzać fragmenty komórek i enzymy. Przenieść supernatant zawierający cząsteczkę barwnika na płytkę wielodołkową.
Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję przy 595 nanometrach.
Porównaj absorbancję próbki poddanej działaniu enzymu z absorbancją próbki niepoddanej działaniu enzymu, aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną białka przeciwdrobnoustrojowego.
W teście uwalniania barwnika substrat jest kowale
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych