Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Zacznij od szkiełka zawierającego utrwalony w formalinie, zatopiony w parafinie wycinek tkanki mózgowej myszy zakażony wirusem wścieklizny. Stały odcinek zatrzymuje antygeny wirusowe poprzez sieciowanie białek.

Potraktuj szkiełko roztworem ksylenu, aby usunąć parafinę.

Zanurz szkiełko w zmniejszającym się stężeniu etanolu, aby nawodnić tkankę, dzięki czemu będzie ona kompatybilna z roztworami wodnymi.

Wprowadzenie buforu zawierającego proteazę w celu przerwania wiązań krzyżowych białek, poprawiając dostępność antygenu.

Zanurz się w nadtlenku wodoru, aby zablokować endogenne peroksydazy i zastosuj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznym interakcjom.

Wprowadzić przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla antygenu wścieklizny, tworząc kompleksy antygen-przeciwciało.

Dodaj biotynylowane przeciwciała drugorzędowe, które wiążą się z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Inkubować z enzymami peroksydazy sprzężonej ze streptawidyną, które oddziałują z biotyną.

Wprowadzić substrat peroksydazy, wytwarzając purpurowo-czerwony osad.

Przeciwbarwić tkankę barwieniem jądrowym, a następnie środkiem niebieszczącym, barwiąc jądra na niebiesko.

Obraz immunohistochemiczny ujawnia purpurowo-czerwone plamki w cytoplazmie, potwierdzając obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Za pomocą mikrotomu wykonaj 5-mikrometrowy przekrój parafiny. Umieść sekcję na łaźni wodnej w temperaturze 38 stopni Celsjusza i zbierz ją na szkiełka podstawowe. Oznacz szkiełka pisakiem odpornym na odczynniki. Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast je odparafinowaj, wykonując trzy kolejne płukania ksylenem po pięć minut każde. Następnie należy ponownie nawodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszających się rozcieńczeniach etanolu do wody dejonizowanej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Traktuj szkiełka proteazą przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego, a następnie płucz szkiełka w PBST przez 10 minut i traktuj je 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut. Następnie ponownie umyj szkiełka PBST przez 10 minut.

Na początek wyjmij jedno szkiełko z bufora, upewniając się, że dotykasz tylko jednego szkiełka na raz, podczas gdy pozostałe pozostają zanurzone, i użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar buforu z okolic sekcji tkanki. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej i inkubuj z normalną kozią surowicą w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej z optymalnym, z góry ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie i przeciwciałami kontroli ujemnej w temperaturze pokojowej przez 60 minut bez przemywania między nimi. Następnie myć szkiełka PBST przez 10 minut i inkubować w komorze wilgotnościowej z biotynylowanym przeciwciałem w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Ponownie umyj szkiełka PBST przez 10 minut. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej z kompleksem streptawidyna-HRP w temperaturze pokojowej przez 15 minut i myć PBST przez 10 minut. Następnie inkubować z AEC w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Myj szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 10 minut i przeciwplamić hematoksyliną Gilla rozcieńczoną 1 do 2 wodą dejonizowaną przez dwie minuty.

Następnie spłucz nadmiar hematoksyliny, zanurzając szkiełka w wodzie dejonizowanej. Opłucz szkiełka w wodzie z kranu Scotta przez 30 sekund i myj w wodzie dejonizowanej przez 10 minut. Zdejmuj szkiełka pojedynczo i montuj je za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego. Następnie użyj mikroskopu świetlnego, aby odczytać szkiełka.