Test do analizy cyklu komórkowego limfocytów T ^CD8+ specyficznych dla antygenu

Weź wtórne komórki narządów limfatycznych od myszy immunizowanej antygenem, zawierające specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 ⁺ na różnych etapach cyklu komórkowego.

G₁, S, G₂ i M są etapami aktywnie dzielących się komórek, podczas gdy komórki w stadium G₀ są w stanie spoczynku.

Dodaj fluorescencyjny barwnik żywotności, aby oznaczyć martwe komórki i przeciwciała znakowane fluoroforem wiążące się z markerami powierzchniowymi limfocytów T CD3 i CD8.

Wprowadź sprzężone z fluoroforem antygenowe multimery peptydowe-MHC do wiązania receptorów limfocytów T, znakując limfocyty T specyficzne dla antygenu.

Za pomocą bufora utrwal i przepuszczalność komórek.

Wprowadź przeciwciała znakowane fluoroforem, aby związać białko jądrowe związane z proliferacją komórek - barwiąc aktywnie dzielące się komórki.

Dodaj barwnik fluorescencyjny, aby oznaczyć DNA.

Za pomocą cytometrii przepływowej wybierz żywe komórki i zidentyfikuj specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8 ⁺ za pomocą etykiet związanych z powierzchnią.

Intensywność barwienia DNA odróżnia komórki G₀ i G₁ o mniejszej ilości DNA od komórek S,_G2 i M o większej ilości DNA. Brak przeciwciała specyficznego dla białka jądrowego oddziela komórki G₀.

Przygotuj świeży bufor do przemywania przepuszczalności 1X, rozcieńczając 10-krotny bufor permeabilizacji wodą destylowaną i przefiltruj go przez filtr 0,45 mikrometra w celu wyeliminowania agregatów. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne Ki67-FITC w 1X permeabilizacyjnym buforze do płukania, jak oznaczono w doświadczeniu miareczkowania dla końcowej objętości 100 mikrolitrów na próbkę.

Dodaj 3 mililitry 1X buforu do przemywania permeabilizacji do każdej probówki z komórkami i odwiruj przy 400 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Ponownie dodaj 1X bufor do przemywania permeabilizacji i odwiruj, aby osadzać komórki, a następnie wyrzuć supernatant.

Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała monoklonalnego Ki67-FITC do osadu, a następnie wiruj i inkubuj przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 4 mililitrami buforu przepuszczalnego 1X, odwirować po każdym przemyciu i wyrzucić supernatant.

Dodać 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być pobrane bezpośrednio w cytometrze przepływowym, i 250 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego w przypadku próbek, które mają być inkubowane z Hoechstem w celu barwienia DNA. Przygotować roztwór Hoechsta i PBS i dodać go do każdej próbki, tak aby końcowe stężenie wynosiło 2 mikrogramy na mililitr. Wirować i inkubować próbki przez 15 minut w ciemności. Następnie odwiruj próbki przez 5 minut i dodaj 350 mikrolitrów PBS do osadu komórkowego.

Otwórz oprogramowanie i utwórz różne grupy odpowiadające różnym narządom, które mają być analizowane, klikając Utwórz grupę w sekcji wstążki obszaru roboczego. Otwórz okno Modyfikuj grupę, klikając dwukrotnie nazwę grupy i zsynchronizuj nowo utworzone grupy, wstawiając znacznik wyboru przy funkcji Zsynchronizowane.

Przeciągnij każdy plik FCS do odpowiedniej grupy, a następnie utwórz strategię bramkowania, zaczynając od grupy LN. Otwórz okno wykresu, klikając dwukrotnie w pełni wybarwioną próbkę, aby wyświetlić niezakłócone zdarzenia uzyskane dla tej próbki na wykresie kropkowym. Należy zauważyć, że osie x i y są oznaczone tak, jak w plikach FCS, jak wskazano w tabeli 2 pliku ustawień cytometru przepływowego w tym manuskrypcie. Sprawdź, czy wyświetlana jest wystarczająca liczba zdarzeń do odpowiedniej wizualizacji.

W razie potrzeby otwórz Preferencje, klikając ikonę serca na wstążce obszaru roboczego, wybierz Wykresy, a następnie Wykres punktowy jako Typ wykresu i sprawdź, czy liczba kropek narysowanych w odpowiednim polu jest poprawna lub zmień ją. Wyświetl zdarzenia nieobjęte w oknie wykresu na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i DNA-W na osi y. Użyj skali liniowej dla obu osi. W razie potrzeby zmień skalę z logarytmicznej na liniową, klikając pole oznaczone literą T blisko każdej osi w oknie wykresu.

Wybierz populację pojedynczych komórek, klikając Prostokąt w sekcji Narzędzia do bramkowania, a następnie kliknij dwukrotnie na środku prostokątnej bramy, aby wyświetlić pojedyncze komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i barwnikiem martwych komórek na osi y.

Kliknij wielokąt, aby wybrać populację żywych komórek, które są ujemne dla barwnika martwych komórek. Kliknij dwukrotnie środek bramki wielokątnej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z parametrem FSC-A na osi x i parametrem SSC-A na osi y.

Kliknij Prostokąt i utwórz "zrelaksowaną" bramę, aby uwzględnić wszystkie pojedyncze żywe komórki na tym wykresie. Kliknij dwukrotnie środek swobodnej bramy, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z CD3 na osi x i CD8 na osi y.

Użyj odpowiedniej skali osi do wizualizacji w oknie wykresu. W razie potrzeby zmodyfikuj skalę x i y, klikając pole oznaczone literą T w pobliżu każdej osi. Wybierz opcję Dostosuj funkcję osi i w razie potrzeby zmodyfikuj dodatkowe dekady ujemne, podstawę szerokości i dekady dodatnie.

Wybierz komórki CD3-dodatnie, CD8-dodatnie, klikając Wielokąt. Kliknij dwukrotnie środek bramki CD3-dodatniej, CD8-dodatniej, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z Tetr-gag na osi x i Pent-gag na osi y. Wybierz specyficzne dla antygenu limfocyty T CD8, klikając Wielokąt. Kliknij dwukrotnie na środku bramki specyficznej dla knebla, aby wyświetlić komórki na wykresie kropkowym z DNA-A na osi x i Ki67 na osi y. Wybierz komórki w różnych fazach cyklu komórkowego, klikając Quad w sekcji Narzędzia do bramkowania w oknie wykresu.