Ocena skuteczności przeciwwirusowego związku testowego za pomocą testu inaktywacji wirusa

Weź probówki z rekombinowanym wirusem zapalenia wątroby typu C lub zawiesiną HCV zawierającą RNA kodujące wydzielany reporter lucyferazy.

Dodać badany związek przeciwwirusowy i rozpuszczalnik do probówek testowych i kontroli ujemnej.

Badane związki wiążą się z glikoproteinami HCV, inaktywując wirusa.

Po inkubacji rozcieńczyć mieszaniny, aby zapobiec interakcjom związek-komórka w kolejnych etapach.

Dodaj te rozcieńczone mieszaniny do monowarstw wątrobiaka wspierających replikację HCV. Inkubować.

Inaktywowany związkiem HCV nie może przyłączać się do określonych receptorów na powierzchni komórki, podczas gdy aktywne glikoproteiny HCV wiążą się z tymi receptorami, ułatwiając przyłączanie komórek.

Usunąć niezaabsorbowane HCV. Przemyć buforem i dodać pożywkę. Inkubować przez dłuższy czas.

Związany HCV jest internalizowany, uwalniając wirusowe RNA i prowadząc do syntezy białek wirusowych i lucyferazy wydzielanych z komórki.

Zbierz supernatanty hodowlane zawierające lucyferazy. Odwirować i dodać substrat lucyferazy do supernatantów.

Lucyferazy utlenia podłoże, emitując światło.

Wyższa luminescencja w studzience kontrolnej niż w teście wskazuje na inaktywację wirusa przez związek.

Aby rozpocząć test inaktywacji wirusa, najpierw umieść 1 razy 10 do czwartej komórki na studzience na 96-dołkowej płytce. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez noc w celu przyłączenia się. Do zakażenia przygotuj wirusa zapalenia wątroby typu C lub cząsteczki HCV znakowane reporterowo Gaussia lucyferazy, zgodnie z odniesieniem w protokole tekstowym.

W sterylnej probówce wymieszaj 100 mikrolitrów 100 mikromolowych lub PUG ze 100 mikrolitrami 10 do czwartej jednostki ogniskującej lub FFU HCV. W celu kontroli pozytywnej należy zmieszać HCV z heparyną w końcowym stężeniu 1,000 mikrogramów na mililitr. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Po trzech godzinach rozcieńczyć mieszaninę związków wirusa 50-krotnie 9,8 mililitra podłoża podstawowego w temperaturze pokojowej. Następnie należy przygotować nową mieszaninę związków wirusowych i natychmiast rozcieńczyć tę mieszaninę w pożywce podstawowej do próbki inkubacji w godzinie zero. Po usunięciu pożywki inkubacyjnej z komórek, dodać 100 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu leku wirusowego do dołka w trzech egzemplarzach.

Roztwór zawiera teraz od 10 do drugiego FFU na studzienkę. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy godziny, aby umożliwić infekcję wirusową komórek. Po inkubacji usuń zawiesinę wirusa ze studzienek i delikatnie umyj komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS.

Inkubować komórki w 100 mikrolitrach podłoża podstawowego przez 72 godziny w celu replikacji wirusa i uwolnienia reportera lucyferazy do supernatantu. Następnie zbierz supernatanty z kultur do mikroprobówek i odwiruj w temperaturze 17 000 razy g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe. Wymieszaj 20 mikrolitrów każdego supernatantu z 50 mikrolitrami odczynnika do oznaczania lucyferazy Gaussia i zmierz luminescencję od aktywności reporterowej lucyferazy w luminometrze.