Name: Technologia IgY: Ekstrakcja przeciwciał kurzych z żółtka jaja przez wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Naucz się ekstrakcji przeciwciał IgY z żółtka jaja kurzego metodą wytrącania glikolem polietylenowym. Protokół ten zapewnia wysoką wydajność izolacji i jest stosowany w badaniach immunologicznych oraz biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana z grantu przyznanego przez Niemieckie Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań (Projekt BiGRUDI 
[Biologische Gefahrenlagen: Risikobewertung, ultraschnelle Detektion 
und Identifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Dziękujemy B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin 
Berlin, Institut für Pharmakologie) za doskonałą pomoc techniczną.

1. Protokół - ekstrakcja IgY za pomocą wytrącania PEG
Ryc. 1 przedstawia schemat procedury ekstrakcji IgY (patrz tabela 2). Protokół ten został po raz pierwszy opisany przez Polson et al. 1980. 
Wszystkie etapy należy przeprowadzać w rękawiczkach lateksowych.
<ol>
 <li>Skorupka jaja jest ostrożnie rozbijana, a żółtko przenoszone na „łyżkę do żółtek” w celu usunięcia jak największej ilości białka jaja.</li>
 <li>Żółtko przenosi się na papier filtracyjny i toczy, aby usunąć pozostałości białka, a następnie błonę żółtka nacinając lancetem lub podobnym narzędziem (końcówką do pipety). Żółtko wlewa się do probówki o pojemności 50 ml i odnotowuje objętość jaja (V1).</li>
 <li>Żółtko miesza się z dwukrotnością jego objętości w PBS (∑V1+V2), po czym dodaje się 3,5% PEG 60 (w gramach, sproszkowany) w stosunku do całkowitej objętości i miesza na vortexie, a następnie toczy przez 10 min w mieszalniku obrotowym. Ten etap procedury ekstrakcji rozdziela zawiesinę na dwie fazy. Jedna faza składa się z „ciał stałych i substancji tłustych żółtka” (cytat oryginalny z Polson et al. 1980), a druga z fazy wodnej zawierającej IgY i inne białka.</li>
 <li>Probówki wiruje się w temperaturze 4°C przez 20 min (10 0 rpm, co odpowiada 13 0 x g, Heraeus Multifuge 3SR+, rotor z kątem stałym). Nadfiltr (V3) przelewa się przez złożony filtr i przenosi do nowej probówki.</li>
 <li>Do probówki dodaje się 8,5% PEG 600 w gramach (obliczone zgodnie z nową objętością), miesza na vortexie i toczy w mieszalniku obrotowym, analogicznie do kroku 3.</li>
 <li>Powtarza się krok 4, z tą różnicą, że nadfiltr zostaje usunięty.</li>
 <li>Osad ostrożnie rozpuszcza się w 1 ml PBS za pomocą szklanej rurki i vortexa. Dodaje się PBS do uzyskania objętości końcowej 10 ml (V4). Roztwór miesza się z 12% PEG 60 (w/v, 1,2 gram) i poddaje obróbce zgodnie z krokiem 3 (vortex, mieszalnik obrotowy).</li>
 <li>Powtarza się krok 6 i ostrożnie rozpuszcza osad w 80 μl PBS (szklana rurka i vortex). Należy odczekać do zniknięcia pęcherzyków powietrza, a następnie przenieść (pipetą) ekstrakt do kapsuły dializacyjnej. Probówkę płucze się 40 μl PBS i dodaje tę objętość do urządzenia dializacyjnego (V5). (W kwestii przygotowania urządzeń i membran dializacyjnych patrz w dodatku).</li>
 <li>Ekstrakt dializuje się przez noc w 0,1% roztworze soli fizjologicznej (1 60 ml), delikatnie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnego dnia roztwór soli zastępuje się PBS i dializuje przez kolejne trzy godziny.</li>
 <li>Następnie ekstrakt IgY wyciąga się z kapsuły dializacyjnej pipetą i przenosi do probówek 2 ml. Objętość końcowa wynosi około 2 ml (V6).</li>
 <li>Zawartość białka (mg/mL) w próbkach mierzy się fotometrycznie przy 280 nm (rozcieńczenie 1:50 w PBS) i oblicza zgodnie z prawem Lamberta-Beera, przyjmując współczynnik ekstynkcji 1,3 dla IgY (patrz Rys. 2); Rys. 4 przedstawia jakość preparatu (czystość i odzysk wynoszą około 80%).</li>
 <li>Zaleca się przechowywanie próbek w alikwotach w temperaturze -20°C (nie zamrażać próbek w temperaturze -70°C).</li>
 <li>Jakość końcowych preparatów analizuje się za pomocą prostej metody SDS-PAGE, zgodnie z opisem w protokole JoVE <a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a></li>
</ol>
 2. Dodatek – przed użyciem woreczek do dializy należy przygotować w następujący sposób, zgodnie z zaleceniami producenta:
<ol>
 <li>
20 worków do dializy tnie się na kawałki o długości 30 cm i umieszcza w szklance gradurowanej o pojemności 20 ml.
 </li>
 <li>
Dodaje się 1,750 ml 5 mM roztworu EDTA.
 </li>
 <li>
Nad workami umieszcza się lejek szklany, aby upewnić się, że są one całkowicie przykryte roztworem EDTA. Roztwór podgrzewa się i gotuje przez 5 min (na płycie grzejnej). Następnie roztwór odlewa, a worki płucze trzy razy wodą destylowaną.
 </li>
 <li>
Ponownie dodaje się 1,750 ml roztworu EDTA, gotuje przez 5 min i płucze trzy razy wodą destylowaną w sposób opisany powyżej.
 </li>
 <li>
Na koniec worki do dializy gotuje się przez 10 min w wodzie destylowanej i przechowuje w temperaturze 4°C. Worki do dializy wyjmuje za pomocą wysterylizowanej pęsety.
 </li>
 </ol>

3. Reprezentatywne wyniki

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="Schemat wytrącania glikolem polietylenowym (PEG); metoda izolacji immunoglobulin z żółtka jaja." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Schemat ekstrakcji IgY za pomocą wytrącania glikolem polietylenowym zgodnie z oryginalnym opisem Polsona i in.. 1980. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">Aby wyświetlić powiększony obraz, kliknij tutaj.</a>

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="Poziomy IgY w zależności od liczby tygodni po immunizacji; wykres liniowy przedstawiający zmianę poziomu białka w czasie u kurcząt." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Kształtowanie się całkowitej zawartości IgY w żółtkach jaj u immunizowanych kur w zależności od wieku. Podano średnią tygodniową zawartość całkowitego IgY/jajo oraz SD (n = 4 kur niosek). Z [Pauly i in. 2009]).

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="Wykresy nieśności kur po immunizacji; dane podłużne, liczba jaj na tydzień, wykresy liniowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rysunek 3. 
 Monitorowanie wydajności niesienia czterech kur uodpornionych różnymi antygenami. Strzałki wskazują daty immunizacji (z [Pauly i wsp. 
 2009]).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">Aby wyświetlić powiększony obraz, kliknij tutaj.</a>

 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="Wynik elektroforezy SDS-PAGE, rozdział białek według masy cząsteczkowej, ścieżki oznaczone jako HC i LC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie poszczególnych preparatów IgY z różnych jaj w warunkach redukujących 
 Ścieżka 1 – marker masy cząsteczkowej, ścieżka 2 – standard IgY, ścieżki 3–5 – różne próbki IgY przygotowane zgodnie z opisem w protokole. Są to preparaty końcowe zgodnie z krokiem 10 protokołu.
HC – łańcuchy ciężkie, LC – łańcuchy lekkie, ? – niewielkie zanieczyszczenia odpowiadające masie cząsteczkowej około 35 kDa (prawdopodobnie fragment C-końcowy prekursora witellogeniny II, [Klimentzou i wsp.., 2006]).
<table border="1">
<tbody >
 <tr>
 <td> </td>
 <td>Kura 21 (Antygen A)</td>
 <td>Kura 2 (Antygen A)</td>
 <td>Kura 19 (Antygen B)</td>
 <td>Kura 23 (Antygen C)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba jaj (całkowite IgY)1, okres 2 lat</td>
 <td>625 (38 g)</td>
 <td>626 (38 g)</td>
 <td>545 (3 g)</td>
 <td>608 (37 g)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba jaj (całkowite IgY), pierwszy rok</td>
 <td>345 (20 g)</td>
 <td>304 (16 g)</td>
 <td>326 (18 g)</td>
 <td>308 (17 g)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba jaj (całkowite IgY), drugi rok</td>
 <td>280 (18 g)</td>
 <td>32 (21 g)</td>
 <td>219 (15 g)</td>
 <td>300 (20 g)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% maksymalnej możliwej liczby jaj (pierwszy rok)2</td>
 <td>106</td>
 <td>93</td>
 <td>10</td>
 <td>95</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% maksymalnej możliwej liczby jaj (drugi rok)</td>
 <td>86</td>
 <td>9</td>
 <td>67</td>
 <td>92</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>liczba przetworzonych jaj</td>
 <td>565</td>
 <td>620</td>
 <td>283</td>
 <td>401</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

1Ilość całkowitego IgY oblicza się mnożąc liczbę jaj przez średnią wartość 60 mg białka na jajo, zgodnie z danymi przedstawionymi na Rysunku 2.



 2Maksymalna możliwa liczba jaj rocznie wynosi 325, zgodnie z informacją od hodowcy.


Tabela 1. Statystyki dwuletnie dotyczące zdolności do niesienia jaj u kur uodpornionych różnymi antygenami. Zdolność do niesienia jaj wyrażona jako procent maksymalnej wydajności czterech kur po immunizacji różnymi antygenami, a także wynik uzyskania IgY w ciągu dwóch lat (patrz również Rys. 3, [Pauly et al. 209]).
<table border="1">
<tbody >
 <tr >
 <td >Nr jaja</td>
 <td >Nr kury / Data zniesienia</td>
 <td >V1[ml] żółtko</td>
 <td >V2[ml] PBS</td>
 <td >1. PEG prec. [g]</td>
 <td >Obj. [ml] po</td>
 <td >2. PEG prec. [g]</td>
 <td >Osad</td>
 <td >3. PEG prec. [g]</td>
 <td >Osad</td>
 <td >Obj. [ml]</td>
 <td >Całkowite białko mg/ml</td>
 <td >Skorygowane całkowite białko mg/ml</td>
 </tr>
 <tr >
 <td > </td >
 <td > </td >
 <td > </td >
 <td >2xV1 ∑V1 + V2 </td >
 <td >3,5% [w/v] ∑V1 + V2 </td >
 <td >prec., centrif. i filtracja V3 </td >
 <td >8,5% [w/v] V3</td >
 <td >rozpuszczony w ml PBS V4</td >
 <td >12% [w/v] V4</td >
 <td >Rozpuszczony w ml PBS V5</td >
 <td >Po dializie przeciwko PBS V6</td >
 <td >A280/ml</td >
 <td >A280/ml:1.3</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >1</td >
 <td >H293 / 2.10.</td >
 <td >15</td >
 <td >30 45</td >
 <td >1.58</td >
 <td >31</td >
 <td >2.63</td >
 <td >10</td >
 <td >1.2</td >
 <td >1.2</td >
 <td >1.7</td >
 <td >35.0</td >
 <td >26.3</td >
 </tr>
 <tr >
 <td >2</td >
 <td >H293 / 23.10.</td >
 <td >13</td >
 <td >26 39</td >
 <td >1.37</td >
 <td >25</td >
 <td >2.12</td >
 <td >10</td >
 <td >1.2</td >
 <td >1.2</td >
 <td >1.7</td >
 <td >28.8</td >
 <td >21.6</td >
 </tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2. Przykładowy protokół wytrącania PEG

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Landesamt fur Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03).

Wybór odpowiedniej metody oczyszczania IgY zależy od skali oczyszczania (laboratoryjnej lub przemysłowej), opłacalności, dostępnej technologii (wyposażenia laboratoryjnego) oraz wpływu na środowisko (gospodarki odpadami). Różne metody ekstrakcji IgY zostały szczegółowo omówione przez De Meulenaer &amp; Huyghebaert (2001, przegląd ten przedstawiono również w pracy Schade et al. 2005). Ogólnie metody te można podzielić na trzy główne grupy:

<ol> 
 <li>
 Metody wytrącania: wykorzystujące siarczan amonu lub sodu, glikol polietylenowy (PEG), kwas kaprylowy oraz karagenian. 
 </li>
 <li>
 Metody chromatograficzne: chromatografia powinowactwa, chromatografia wymiany jonowej, chromatografia oddziaływań hydrofobowych, chromatografia oddziaływań tiofilowych oraz chromatografia żelowa.
 </li>
 <li>
 Ultrafiltracja.
 </li>
</ol> 
Czystość preparatu IgY można zwiększyć poprzez zastosowanie kombinacji metod; na przykład wytrącanie PEG można połączyć z chromatografią powinowactwa. W niektórych przypadkach, w zależności od końcowego zastosowania, ekstrakt wodny IgY jest wystarczający do uzyskania dobrych wyników (Akita &amp; Nakai 1993). Z naszego doświadczenia wynika, że próbka IgY otrzymana poprzez wytrącanie PEG sprawdziła się bardzo dobrze w wielu różnych analizach immunologicznych. Dzięki standaryzacji metody wytrącania PEG jeden asystent techniczny jest w stanie przetworzyć około 84 jaj tygodniowo, co odpowiada ilości całkowitego IgY od 4 do 7 g na tydzień. Proste obliczenie: nioska zostaje zimmunizowana antygenem. Po kilku dawkach przypominających kura produkuje specyficzne przeciwciała (Ab) o mianie 1:50 000 w okresie 30 dni. 30 jaj x 2 ml ekstraktu IgY (patrz protokół i Ryc. 3) odpowiada 60 ml całkowitego IgY, co z kolei odpowiada rozcieńczeniu Ab wynoszącemu 3 000 l (pojemność wiadra wynosi 10 l), co oznacza, że 3 000 l roztworu Ab pozwala napełnić 300 wiader. Zatem, biorąc pod uwagę tak ogromną ilość Ab, przechowywanie puli Ab o stałej jakości i swoistości nie stanowi problemu. Technika ta redukuje zmienność między partiami, która jest zazwyczaj obserwowana w przypadku przeciwciał polispecyficznych.

 Pomijając kwestię ilości, przeciwciała IgY wykazują dodatkowe zalety w porównaniu z ssaczymi IgG: brak aktywacji ssaczego układu dopełniacza, brak reaktywności krzyżowej z HAMA (ludzkimi przeciwciałami przeciwko przeciwciałom mysim), czynnikami reumatoidalnymi lub antygenami grup krwi człowieka (brak heteroaglutynin).


Wyjątkową zaletą przeciwciał IgY jest tzw. dystans filogenetyczny. Dystans filogenetyczny jest przyczyną często opisywanych różnic w specyficzności przeciwciał u ssaków i kurcząt, nawet przy identycznej immunizacji. Oprócz różnic między samym układem odpornościowym ssaków i ptaków, do odmiennej specyficzności przeciwciał przyczyniają się różnice w rozwoju filogenetycznym tych dwóch klas zwierząt. Kilku autorów wskazało, że kurczęta często produkują przeciwciała przeciwko filogenetycznie wysoce konserwatywnym białkom lub peptydom ssaków efektywniej niż króliki (przegląd w Schade et a. 2005). W konsekwencji konserwatywny antygen może pozostać „zamaskowany” dla układu odpornościowego królika, wywołując tym samym jedynie słabą lub „milczącą” odpowiedź. Co więcej, jeśli kurczęta i króliki zostaną zimmunizowane tym samym antygenem ssaczym, kurczęta bardzo często odpowiadają specyficznością przeciwciał, której rzadko udaje się osiągnąć u królików. Ważny jest również aspekt dobrostanu zwierząt, ponieważ przeciwciała są pozyskiwane nieinwazyjnie z żółtka jaja. W połączeniu z immunizacją za pomocą armatki genowej (plazmidowej), produkcja IgY jest całkowicie nieinwazyjna (Witkowski et al. 2009).
 
 
Podsumowując, produkcja przeciwciał w organizmach kur oraz ekstrakcja IgY za pomocą wytrącania PEG jest bardzo kosztowo efektywna i pozwala na uzyskanie przeciwciał o wysokiej swoistości i stabilnych mianach do 1:1 000 000. Ze względu na odległość filogenetyczną między Aves a Mammalia, kury są w stanie produkować swoiste przeciwciała przeciwko wysoko konserwowanym antygenom ssaków, w przeciwieństwie np. do królików. Nadzwyczajna ilość przeciwciał uzyskiwana dzięki technologii IgY otwiera również drogę do zastosowania przeciwciał IgY w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej do celów terapeutycznych i profilaktycznych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt;&lt;Li&gt;Worek do dializy Visking, typ 27/32, próg odcięcia -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Probówki Falcon Blue Max, probówka stożkowa 50 ml z polipropylenu, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Filtr fałdowany MN 615 &amp;#188;, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy Heraeus &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Mieszadło magnetyczne, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschlei&amp;#223;Heim, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;kapsułka do mikrodializy 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Fotometr UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;glikol polietylenowy 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Gotowy do użycia bufor PBS 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt; Mieszadło walcowe SRT2, Stuart, Staffordshire, UK &lt;/li&gt;&lt;li&gt; Vibrofix VF2, Janke &amp;amp; Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Niemcy &lt;/li&gt;&lt;li&gt;Łyżka do żółtek, Fackelmann (artykuły gospodarstwa domowego), Niemcy &lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

technologia igy: wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (peg)

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Kury można immunizować poprzez szczepienie domięśniowe (i.m.) (Musculus pectoralis, lewy i prawy, objętość wstrzyknięcia 0.5-1.0 ml) lub za pomocą immunizacji plazmidowej przy użyciu genu-pistoletu (Gene-Gun). W zależności od immunogenności antygenu, wysokie miana przeciwciał (do 1:100 000 – 1:1 000 000) można osiągnąć już po jednej lub 3–4 dawkach przypominających. Zazwyczaj kura znosi jaja w sposób ciągły przez około 72 tygodnie, po czym wydajność znoszenia spada. Niniejszy protokół opisuje ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą procedury wytrącania (PEG, Polson et al. 1980). Metoda ta obejmuje dwa kluczowe etapy. Pierwszym jest usuwanie lipidów, a drugim wytrącanie całkowitego IgY z nadfiltratu uzyskanego w pierwszym kroku. Po dializie przeciwko buforowi (zazwyczaj PBS) ekstrakt IgY można przechowywać w temperaturze -20°C przez ponad rok. Czystość ekstraktu wynosi około 80%, a całkowita ilość IgY na jajo waha się od 40-80 mg, w zależności od wieku nioski. Całkowita zawartość IgY wzrasta wraz z wiekiem kury od około 40 mg/jajo do 80 mg/jajo (w odniesieniu do wytrącania PEG). Roczna wydajność znoszenia jaj przez jedną kurę wynosi około 325 jaj. Oznacza to całkowity potencjalny zbiór 20 g całkowitego IgY/rok, zakładając średnią zawartość 60 mg całkowitego IgY/jajo (patrz Tabela 1).

Niniejszy protokół opisuje w szczególności ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą precypitacji glikolem polietylenowym i przekazuje ogólne informacje na temat technologii IgY.

Technologia IgY: Wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Kury można uodpornić poprzez szczepienie domięśniowe (mięsień piersiowy, lewy i prawy, objętość iniekcji 0,5–1,0 ml) lub za pomocą pistoletu genowego (Gene-Gun) ...

W niniejszym filmie zaprezentowano izolację przeciwciał IGY od kur, które mogą być immunizowane za pomocą gumy genowej, plazmidu lub w sposób bardziej tradycyjny poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. W pierwszej kolejności izoluje się żółtko jaja. Następnie przeprowadza się wytrącanie lipidów, po którym następuje wytrącanie frakcji białkowej zawierającej przeciwciała, które są izolowane w kolejnym etapie wytrącania.Na koniec przeciwciała poddaje się dializie przeciwko PBS. Tak. Dzień dobry. Nazywam się Ard. To jest moja koleżanka, Adema, a pracujemy tutaj w bardzo starym i słynnym Instytucie Farmakologii, który należy do SHA University Medicine w Berlinie.W dalszej części chcielibyśmy zaprezentować ekstrakcję IGY z żółtka jaja kurzego; jest to metoda bardzo prosta, a jednocześnie bardzo efektywna kosztowo. Całość ta mieści się w ramach tzw. technologii IGY. Pierwszym krokiem przygotowania IGY jest izolacja żółtka jaja.Do tej procedury potrzebujemy statywów na probówki, papieru filtracyjnego z niebieskimi nakrętkami, końcówek do pipet, buforu, zlewki szklanej, łyżki do oddzielania żółtka od białka oraz oczywiście jajek. Jajko rozbija się nad łyżką do żółtek, aby odlać białko. Następnie łyżkę z żółtkiem delikatnie potrząsa się, aby usunąć większość pozostałego białka.Następnie żółtko przenosi się na papier filtracyjny, aby możliwie całkowicie usunąć białka białka jaja. Błona żółtka jest bardzo stabilna w jajach nie starszych niż miesiąc, w przypadku przechowywania dłuższego niż trzy miesiące. Błona żółtka może pęknąć w wyniku procesu starzenia podczas rozwałkowywania na papierze filtracyjnym.Następnie skórkę żółtka otwiera się za pomocą końcówki pipety i przenosi ją do probówki. Na koniec można zauważyć, że objętość żółtka wynosi około 15 mililitrów. Taka objętość jest prawidłowa dla dorosłej kury nioski i wykazuje jedynie minimalne różnice.Odnotowano objętość żółtka. W celu oddzielenia białek żółtka, w tym IGY, od lipidów zawartych w żółtku jaja, w buforze PBS stosuje się 3,5% glikolu polietylenowego jako czynnika wytrącającego; na wadze odważa się 1,58 grama glikolu polietylenowego, co odpowiada 3,5% końcowej objętości żółtka i buforu. 15 mililitrów żółtka miesza się z dwukrotną objętością buforu PBS, zatem dodaje się 30 mililitrów PBS do uzyskania końcowej objętości 45 mililitrów. Następnie do mieszaniny dodaje się glikol polietylenowy.Probówkę zamyka się zakrętką, a następnie miesza intensywnie w wstrząsarze vortex przez 20 do 30 sekund. Probówkę należy okresowo odwracać podczas procedury mieszania w wstrząsarzu.Po wirowaniu w vortexie żółtko powinno być całkowicie w zawiesinie. Następnie probówki umieszcza się na mieszalniku rolkowym na 10 minut. Wynikiem jest jednorodna mieszanina, której kolor zmienił się z żółtego na jasnoczarowy.Następnie mieszaninę wiruje się przez 20 minut. Wirowanie oddziela klarowny nadosad zawierający IGY oraz inne białka od żółtego osadu, który składa się głównie z lipidów. W kolejnym kroku nadosad przelewa się przez złożony filtr i przenosi do nowej probówki.Odczytuje się nową objętość, a osad jest odrzucany. Następnie ponownie dodaje się glikol polietylenowy do supernatantu do stężenia końcowego 12% Oznacza to 3,5% w pierwszej precypitacji oraz 8,5% objętości otrzymanego SNAT, co daje łącznie 12% Następnie roztwór jest mieszany i inkubowany na mieszalniku rolkowym jak poprzednio, a potem wirowany przez 20 minut. W tym etapie glikol polietylenowy powoduje wytrącenie IGY oraz innych białek.Po tym etapie wirowania osad zostanie wykorzystany do przygotowania do rozpuszczania. Patyczki szklane służące do zbierania osadu są dezynfekowane 70% etanolem; w czasie gdy patyczki schną, supernatant S zostaje odrzucony. Następnie probówkę odwraca się, aby odprowadzić resztki supernatantu.Następnie do osadu dodaje się 1 mL PBS. Osad rozpuszcza się za pomocą szklanego pręcika, intensywnie mieszając na wortexie. W tym momencie otrzymujemy roztwór o lekko żółtym zabarwieniu.Następnie dodaje się PBS do uzyskania objętości końcowej 10 ml, po czym przeprowadza się trzecie wytrącanie glikolem polietylenowym w stężeniu 12%, analogicznie jak poprzednio, w przeciwieństwie do drugiej wirowania. Tym razem po wirowaniu przez 20 minut otrzymuje się biały osad. Osad rozpuszcza się w ten sam sposób co wcześniej, jednak w dwóch etapach.W pierwszym kroku substancję rozpuszcza się w 0,8 ml PBS i przenosi do kapsułki do mikrodializy. Następnie probówkę płucze się dodatkowymi 0,4 ml PBS, które również przenosi się do kapsułki. W kolejnym kroku worek do dializy odcina się zdezynfekowanymi nożyczkami i płucze wodą destylowaną.Worek dializacyjny umieszcza się następnie na dolnej części kapsuły i szczelnie zamyka górną częścią. Na koniec kapsuły przenosi się do szklanego zlewki ustawionej na mieszadle magnetycznym. Roztwór IGY dializuje się przez noc przeciwko 0,1% soli fizjologicznej.Następnego dnia roztwór IGY poddaje się dializie przez trzy godziny przeciwko PBS. Po zakończeniu dializy membranę dializacyjną przebija się końcówką pipety, a roztwór IGY usuwa i przenosi do małej probówki. Należy odnotować objętość końcową.Produkt końcowy stanowi klarowny roztwór, który można przechowywać w temperaturze -20°C przez kilka lat. Z naszego doświadczenia wynika, że preparatu IGY nie należy przechowywać w temperaturze -70°C, ponieważ zaobserwowaliśmy w tej temperaturze znaczny spadek aktywności. Mamy nadzieję, że udało nam się przekonać Państwa, iż ekstrakcja IDY jest naprawdę prostą i skuteczną procedurą przy zastosowaniu naszego protokołu.Wymagane wyposażenie było minimalne i uważamy, że stosunek nakładu pracy do korzyści jest korzystny. Mam nadzieję, że ta publikacja wideo zachęci Państwa do efektywnego korzystania z naszego protokołu oraz technologii, tak jak ja będę to robić. Dziękuję.

igy-technology-extraction-chicken-antibodies-from-egg-yolk

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technologia IgY: Ekstrakcja przeciwciał kurczaka z żółtka jaja za pomocą osadzania polietylenoglikolem (PEG)

W tym filmie pokazujemy immunologiczne wytrącanie fosfopeptydów z mieszaniny peptydów na podstawie przeciwciał. Wzbogacone fosfopeptydy są zagęszczane próżniowo i przechowywane do dalszej analizy.

Wzbogacanie fosfopeptydów: technika immunoprecypitacji oparta na przeciwciałach w celu oddzielenia specyficznych fosforylowanych peptydów od złożonych mieszanin peptydowych

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Identyfikacja cząsteczek związanych z konkretnymi regionami genomu będącymi przedmiotem zainteresowania jest konieczna, aby zrozumieć mechanizmy regulacji funkcji tych regionów. Protokół ten opisuje procedury przeprowadzania imunoprecipitacji chromatyny za pośrednictwem cząsteczki wiążącej DNA (enChIP) w celu identyfikacji białek i RNA związanych z określonym regionem genomu.

Izolacja określonych regionów genomu i identyfikacja powiązanych cząsteczek za pomocą enChIP

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Ta metoda dostarcza ram do badania inkorporacji egzogennych kwasów tłuszczowych z kompleksowych źródeł gospodarza do błon bakteryjnych, szczególnie Staphylococcus aureus. Aby to osiągnąć, opisano protokoły wzbogacania cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego i późniejszego profilowania fosfolipidów bakteryjnych za pomocą spektrometrii mas.

Izolacja cząstek lipoprotein z żółtka jaja kurzego w celu zbadania włączenia kwasów tłuszczowych patogenów bakteryjnych do fosfolipidów błonowych

Ten artykuł opisuje prostą metodę izolowania zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywitelinowych jaj kurzych przy jednoczesnej minimalizacji zmian strukturalnych i optymalizacji solubilizacji białek w każdej podwarstwie do analiz proteomicznych.

Mechaniczna separacja i solubilizacja białek zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywiteliny z jaj kurzych

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Ten protokół opisuje metodologię przygotowania kulek lateksowych do testów z użyciem przeciwciał IgY do wykrywania antygenów.

Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

Interakcje białko-białko są ważne dla wyjaśnienia funkcji docelowych białek, a koimmunoprecypitacja (co-IP) może łatwo potwierdzić IPP. Przejściowo transfekowaliśmy plazmid kodujący białko znakowane epitopem do komórek HEK-293 i opracowaliśmy metodę immunoprecypitacji, aby łatwo potwierdzić wiązanie dwóch białek docelowych.

Immunoprecypitacja za pomocą żelu powinowactwa do znaczników antyepitopowych w celu zbadania interakcji białko-białko

Naucz się ekstrakcji przeciwciał IgY z żółtka jaja kurzego metodą wytrącania glikolem polietylenowym. Protokół ten zapewnia wysoką wydajność izolacji i jest stosowany w badaniach immunologicznych oraz biotechnologii.

Technologia IgY: Wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Przeglądaj więcej filmów