Wytwarzanie wariantów ucieczki wirusa grypy przeciwko przeciwciałom neutralizującym

Należy pobrać zawiesinę wirusa grypy, zawierającą zarówno szczepy typu dzikiego, jak i zmutowane.

Glikoproteina otoczki wirusa zwana hemaglutyniną lub HA wiąże się z kwasem sjalowym na powierzchni komórki gospodarza, pośrednicząc w wnikaniu wirusa.

Dodaj przeciwciało neutralizujące w malejących stężeniach, które wiąże się z kwasem hialowym, blokując miejsce wiązania kwasu sjalowego.

Zmutowane szczepy, przenoszące mutacje w HA, które pomagają uniknąć neutralizacji przeciwciał, nazywane są wariantami ucieczki.

Wstrzyknąć mieszaninę do wolnych od patogenów zarodków kurzych, dostarczając wirusy do płynu omoczniowego i inkubować.

Wirusy zneutralizowane przez przeciwciała nie mogą przedostać się do komórek błony kosmówkowej omoczniowej. Niezneutralizowane zmutowane wirusy dostają się do komórek, replikują się i są uwalniane do płynu omoczniowego.

Zbierz płyn omoczniowy zawierający populację wirusa.

Wprowadzić przeciwciało swoiste dla HA w malejących stężeniach, które neutralizuje inne szczepy z wyjątkiem wariantów ucieczki.

Wprowadź czerwone krwinki kurczaka lub RBC. Niezneutralizowane warianty ucieczki wiążą się z komórkami, powodując zlepianie się erytrocytów - zwane hemaglutynacją, potwierdzające generowanie wariantu ucieczki.

Przeciwciała neutralizujące, które mają aktywność HI, są dalej analizowane, najpierw przygotowując 4 rozcieńczenia interesującego przeciwciała w zwiększających się stężeniach w 1 krotności PBS w objętości 100 mikrolitrów na rozcieńczenie. Następnie przygotuj zapas wirusa składający się z 1 miliona jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr w 1 porazliwości PBS w objętości 400 mikrolitrów.

Następnie zmieszaj 100 mikrolitrów 1 miliona jednostek tworzących płytki nazębne na mililitr wirusa ze 100 mikrolitrami każdego rozcieńczenia przeciwciała lub 100 mikrolitrami 1 razy PBS. Inkubuj próbki przez godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po krótkim wirowaniu wstrzyknąć 200 mikrolitrów każdej mieszaniny do określonych zarodków jaj kurzych wolnych od patogenów. Następnie wysiaduj jaja w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez dwutlenku węgla przez 40 do 44 godzin. Po inkubacji należy złożyć zarodki jajowe zakażone wirusem, umieszczając je w temperaturze 4 stopni Celsjusza na co najmniej 6 godzin. Następnie zbierz płyn omoczniowy z jaj, jak opisano wcześniej.

Na koniec potwierdź warianty ucieczki, wykonując test HI zgodnie z opisem w protokole tekstowym.