Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Zacznij od wielodołkowej płytki o płaskim dnie, zawierającej przylegający mysi mikroglej - komórki fagocytarne w mózgu.

Wprowadzić pożywkę bez surowicy zawierającą immunokompleksy. Kompleksy te składają się z przeciwciał przyłączonych do fosforylowanych agregatów białka Tau, które powstają podczas niektórych chorób neurodegeneracyjnych.

Agregaty Tau są znakowane wrażliwym na pH zielonym barwnikiem fluorescencyjnym.

Podczas inkubacji te immunokompleksy oddziałują z receptorami Fc komórek mikrogleju, ułatwiając ich pochłanianie.

Ten endosom zawierający immunokompleks łączy się z lizosomem, tworząc endolizosom. Kwaśne środowisko endolizosomu powoduje fluoryzację cząsteczek barwnika.

Umyć w celu usunięcia niezinternalizowanych immunokompleksów.

Potraktuj roztworem trypsyny-EDTA, aby odłączyć komórki.

Przenieś zawiesinę komórkową na dolną płytkę w kształcie litery U umieszczoną nad lodem, aby ustabilizować endolizosom. Osadzać komórki i wyrzucać supernatant.

Umyj i ponownie zawieś ogniwa za pomocą buforu FACS.

Za pomocą FACS zidentyfikuj pojedyncze żywe komórki i określ ilościowo intensywność zielonej fluorescencji, aby ocenić wychwyt Tau przez mikroglej.

W pierwszym dniu eksperymentu należy przygotować komórki BV-2, najpierw myjąc je 1x PBS w kolbie, w której zostały wyhodowane. Następnie inkubuj je z 0,05% trypsyną EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO₂ , aż oderwą się od kolby. Ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej, pipetując w górę i w dół 3 do 5 razy.

Policz komórki i przygotuj zawiesinę komórkową o końcowym stężeniu 100 000 komórek na mililitr w pożywce hodowlanej zawierającej 200 mikrogramów na mililitr heparyny. Dodaj 250 mikrolitrów tej zawiesiny komórek na studzienkę na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem do hodowli tkankowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO_{2 przez} noc.

Po rozmrożeniu wcześniej przygotowanych agregatów barwnika pH Tau na lodzie, rozcieńczyć je w 65 mikrolitrach na stan pożywki wolnej od surowicy, aby uzyskać roztwór o natężeniu 500 nanomolowym. Rozcieńczyć przeciwciała w 65 mikrolitrach pożywki bez surowicy, aby osiągnąć podwójne pożądane stężenie. Wymieszaj agregaty barwnika pH Tau i przeciwciała w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U. Uszczelnić tę płytkę rozcieńczającą i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wyjąć pożywkę z 96-dołkowej płytki z komórkami BV-2. Umyj komórki w każdej studzience 100 mikrolitrami temperatury pokojowej 1x PBS. Usunąć PBS z płytki ogniwa BV-2. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 125 mikrolitrów immunokompleksów z płytki rozcieńczającej do każdego dołka 96-dołkowej płytki komórkowej BV-2 i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO₂ .

Po inkubacji usunąć immunokompleksy z komórek i umyć komórki w każdej studzience 100 mikrolitrami temperatury pokojowej 1x PBS. Po usunięciu 1x PBS dodaj 50 mikrolitrów 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO₂. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej i ponownie zawieś studzienkę, pipetując w górę iw dół, aby odłączyć komórki.

Przenieś komórki na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U i odwiruj ją w temperaturze 400 razy g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Umieść talerz na lodzie i usuń podłoże. Dodaj 150 mikrolitrów lodowatego 1x PBS i ponownie odwiruj przy 400 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Umieść płytkę na lodzie i ponownie umyj, usuwając wcześniej dodany 1x PBS i dodając 150 mikrolitrów lodowatego PBS na dołek. Odwirować ponownie w tych samych warunkach.

Umieść płytkę na lodzie i umyj komórki, usuwając wcześniej dodany PBS i dodając 150 mikrolitrów buforu FACS na studzienkę. Ponownie odwirować przy 400 g przez 5 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Umieść płytkę na lodzie i usuń wcześniej dodany bufor FACS, a następnie ponownie zawieś komórki w buforze FACS o pojemności 200 mikrolitrów na studzienkę. Natychmiast przystąp do analizy przez FACS, aby uzyskać 20 000 zdarzeń w bramie żywej komórki.