Name: Testy biofizyczne do badania właściwości mechanicznych jądra komórkowego w interfazie: zastosowanie szczepu substratu i manipulacja mikroigłami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 27 s
Description: Poznaj metody pomiaru właściwości mechanicznych jądra komórkowego i transmisji sił wewnątrzkomórkowych przy użyciu szczepu substratu i manipulacji mikroigłami w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health (R01 HL082792 oraz R01 NS059348) oraz Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Leadership Group Award.

<ol><li>Friedl, P., Wolf, K., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanics+during+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanics during cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 55-64 (2011).</li>
<li>Mejat, A., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">LINC complexes in health and disease.</a> Nucleus. 1, 40-52 (2010).</li>
<li>Worman, H. J., Fong, L. G., Muchir, A., Young, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminopathies+and+the+long+strange+trip+from+basic+cell+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Laminopathies and the long strange trip from basic cell biology to therapy.</a> J Clin Invest. 119, 1825-1836 (2009).</li>
<li>Caille, N., Tardy, Y., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+strain+field+in+endothelial+cells+subjected+to+uniaxial+deformation+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Assessment of strain field in endothelial cells subjected to uniaxial deformation of their substrate.</a> Ann Biomed Eng. 26, 409-416 (1998).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins+A+and+C+but+not+lamin+B1+regulate+nuclear+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics.</a> J Biol Chem. 281, 25768-25780 (2006).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+nuclear+shape+and+impaired+mechanotransduction+in+emerin-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells.</a> J Cell Biol. 170, 781-791 (2005).</li>
<li>Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+deficiency+causes+defective+nuclear+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction.</a> J Clin Invest. 113, 370-378 (2004).</li>
<li>Verstraeten, V. L., Ji, J. Y., Cummings, K. S., Lee, R. T., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mechanosensitivity+and+nuclear+stiffness+in+Hutchinson-Gilford+progeria+cells%3A+effects+of+farnesyltransferase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Increased mechanosensitivity and nuclear stiffness in Hutchinson-Gilford progeria cells: effects of farnesyltransferase inhibitors.</a> Aging Cell. 7, 383-393 (2008).</li>
<li>Brooks, S. V., Zerba, E., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+to+muscle+fibres+after+single+stretches+of+passive+and+maximally+stimulated+muscles+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice.</a> J Physiol. 488, 459-469 (1995).</li>
<li>Maniotis, A. J., Chen, C. S., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+mechanical+connections+between+integrins%2C+cytoskeletal+filaments%2C+and+nucleoplasm+that+stabilize+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments, and nucleoplasm that stabilize nuclear structure.</a> Proc Natl Acad Sci. 94, 849-854 (1997).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Analiza szczepów substratu
Aplikacja odkształcenia była z powodzeniem stosowana przez nas i inne grupy do badania indukowanych deformacji jądra w komórkach poddanych stresowi mechanicznemu oraz do badania wpływu specyficznych białek otoczki jądrowej na sztywność jądra.4-8 Zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badać właściwości mechaniczne żywych jąder w ich naturalnym środowisku komórkowym i cytoszkieletowym, a aplikacja odkształcenia podłoża przypomina aplikację obciążeń fizjolo...

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna</td><td>EMD Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red FM i Green FM</td><td>Invitrogen</td><td>M22425 i M-7514</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;bufor fizjologiczny z solą (BSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez fenolu</td><td>Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Aleken Biologicals</td><td>FBSS500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe z włóknem </td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz silikonowy błyszczący/błyszczący, niezbrojony, 0,005&quot;</td><td>Specialty Manufacturing Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor solny z fosforanem (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>szalki hodowlane z dna szklanego o średnicy 35 mm (FluoroDish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy Braycote 804</td><td>SPI Supplies</td><td>05133A-AB</td><td></td></tr></tbody></table>

analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

W większości komórek eukariotycznych jądro jest największą organellą i jest zazwyczaj od 2 do 10 razy sztywniejsze niż otaczający je cytoškielet; w konsekwencji właściwości fizyczne jądra znacząco wpływają na ogólne zachowanie biomechaniczne komórek w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Na przykład w migrujących neutrofilach i naciekających komórkach nowotworowych sztywność jądra może stanowić główną przeszkodę podczas ekstrawasacji lub przechodzenia przez wąskie przestrzenie w tkankach.1 Z drugiej strony, jądra komórek w tkankach aktywnych mechanicznie, takich jak mięśnie, wymagają wystarczającego wsparcia strukturalnego, aby wytrzymać powtarzający się stres mechaniczny. Co ważne, jądro jest ściśle zintegrowane z architekturą komórkową; jest ono fizycznie połączone z otaczającym je cytoškieletem, co jest kluczowym wymogiem dla wewnątrzkomórkowego ruchu i pozycjonowania jądra, na przykład w komórkach spolaryzowanych, jądrach synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych lub w komórkach migrujących.2 Nic dziwnego, że niedawno wykazano, iż mutacje w białkach otoczki jądrowej, takich jak lamine i nespryny, które odgrywają krytyczną rolę w określaniu sztywności jądra i sprzężenia jądro-cytoškieletowego, prowadzą do szeregu ludzkich chorób, w tym dystrofii mięśniowej Emerygo-Dreifussa, obręczowej dystrofii mięśniowej oraz rozstrzeniowej kardiomiopatii.3 Aby zbadać funkcję biofizyczną różnych białek otoczki jądrowej oraz wpływ specyficznych mutacji, opracowaliśmy metody eksperymentalne do badania właściwości fizycznych jądra w pojedynczych, żywych komórkach poddanych globalnemu lub lokalnemu zaburzeniu mechanicznemu. Pomiar indukowanych deformacji jądra w odpowiedzi na precyzyjnie zastosowane odkształcenie podłoża dostarcza ważnych informacji o odkształcalności jądra i pozwala na ilościowe porównanie różnych mutacji lub linii komórkowych z niedoborem specyficznych białek otoczki jądrowej. Lokalna aplikacja odkształcenia cytoškieletu za pomocą mikroiły jest stosowana jako uzupełnienie tego testu i może dostarczyć dodatkowych informacji o wewnątrzkomórkowym przenoszeniu sił między jądrem a cytoškieletem. Badanie mechaniki jądra w nienaruszonych żywych komórkach pozwala zachować normalną architekturę wewnątrzkomórkową i uniknąć potencjalnych artefaktów, które mogą pojawić się podczas pracy z izolowanymi jądrami. Ponadto aplikacja odkształcenia podłoża stanowi dobry model stresu fizjologicznego doświadczanego przez komórki w mięśniach lub innych tkankach (np. komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych poddane odkształceniu naczyniowemu). Wreszcie, choć narzędzia te zostały opracowane głównie do badania mechaniki jądra, mogą one być również stosowane do badania funkcji białek cytoškieletowych i sygnalizacji mechanotransdukcyjnej.

Przedstawiamy dwa niezależne narzędzia oparte na mikroskopii, służące do pomiaru indukowanych odkształceń jądra i cytoszkieletu w pojedynczych, żywych komórkach przylegających w odpowiedzi na globalne lub lokalne przyłożenie naprężenia. Techniki te są wykorzystywane do określenia sztywności jądra (tj. odkształcalności) oraz do badania wewnątrzkomórkowej transmisji sił pomiędzy jądrem a cytoszkieletem.

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

W większości komórek eukariotycznych jądro komórkowe jest największą organellą i zazwyczaj jest od 2 do 10 razy sztywniejsze niż otaczający je cytoszkielet; w związku z tym...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest pomiar właściwości mechanicznych interfejsu jądra komórkowego oraz jego fizycznego połączenia z otaczającym go cytoszkieletem. Osiąga się to poprzez przyłożenie odkształcenia mechanicznego do komórek wysianych na przezroczystej membranie silikonowej i obrazowanie indukowanych deformacji jądra. Zwiększone deformacje jądra odpowiadają zmniejszonej sztywności jądra, ponieważ zmiany w sprzężeniu jądro-cytoszkielet również mogą wpływać na indukowane deformacje jądrowe.Wewnątrzkomórkową transmisję sił między cytoszkieletem a jądrem badano bezpośrednio poprzez przyłożenie zlokalizowanego odkształcenia do cytoszkieletu. Następnie obrazowano przemieszczenie fluorescencyjnie znakowanych struktur jądrowych NU oraz cytoszkieletowych. Otrzymane wyniki obrazują sztywność jąder komórkowych w stosunku do otaczającego je cytoszkieletu.Na podstawie eksperymentów z naprężeniem podłoża, test manipulacji mikroigłami wykazuje, że zaburzenie sprzężenia nukleo-cytoszkieletowego powoduje wady w wewnątrzkomórkowym przekazywaniu sił. Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aspiracja mikropipetą izolowanych jąder, jest to, że u

biophysical-assays-to-probe-mechanical-properties-interphase-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Testy biofizyczne do badania właściwości mechanicznych jądra komórkowego interfazowego: stosowanie naprężenia podłoża i manipulacja mikroigłami

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Prezentujemy w tym artykule nowatorską platformę rozciągającą, która może być wykorzystana do badania reakcji pojedynczych komórek na złożone anizotropowe dwuosiowe deformacje mechaniczne i ilościowego określania właściwości mechanicznych tkanek biologicznych.

Nowatorska platforma do rozciągania do zastosowań w mechanobiologii komórek i tkanek

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Prezentujemy metodę wstrzykiwania komórek za pomocą technologii strumienia wody bez użycia igieł w połączeniu z kontynuacją badań po porodzie pod kątem żywotności komórek, proliferacji i pomiarów elastyczności.

Iniekcja komórek zrębu tkanki tłuszczowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej świń za pomocą technologii strumienia wody

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Badanie zachowania komórek pod wpływem stresu mechanicznego jest kluczowe dla postępów w mechanice komórkowej i mechanobiologii. Wprowadzamy technikę aspiracji mikropipetami fluorescencyjnymi (fMPA), nowatorską metodę łączącą kontrolowaną stymulację mechaniczną z kompleksową analizą sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w pojedynczych komórkach. Technika ta pozwala na przeprowadzenie nowych, dogłębnych badań nad mechanobiologią żywych komórek.

Test aspiracji mikropipet fluorescencyjnych w celu zbadania mechanosensacji czerwonych krwinek

Poznaj metody pomiaru właściwości mechanicznych jądra komórkowego i transmisji sił wewnątrzkomórkowych przy użyciu szczepu substratu i manipulacji mikroigłami w żywych komórkach.

Testy biofizyczne do badania właściwości mechanicznych jądra komórkowego w interfazie: zastosowanie szczepu substratu i manipulacja mikroigłami (Wideo) | JoVE Journal

Analizy biofizyczne służące do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształcenia podłoża i manipulacja mikroiłką

Przeglądaj więcej filmów