Biofizyczne testy do badania właściwości mechanicznych interfazy jądra komórkowego: aplikacja odkształceń podłoża i manipulacja mikroigłami

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest pomiar właściwości mechanicznych interfejsu jądra komórkowego oraz jego fizycznego połączenia z otaczającym cytozeszkieletem. Osiąga się to poprzez przyłożenie odkształcenia mechanicznego do komórek wysianych na przezroczystej membranie silikonowej i obrazowanie indukowanych deformacji jądra. Zwiększone deformacje jądra odpowiadają zmniejszonej sztywności jądra, ponieważ zmiany w sprzężeniu jądrowo-cytoszkieletowym mogą również wpływać na indukowane deformacje jądra.

Wewnątrzkomórkową transmisję sił między cytoszkieletem a jądrem komórkowym badano bezpośrednio poprzez przyłożenie lokalnego odkształcenia do cytoszkieletu. Następnie obrazowano przemieszczenie fluorescencyjnie znakowanych struktur jądrowych NU i cytoszkieletowych. Uzyskane wyniki obrazują sztywność jąder komórkowych w stosunku do otaczającego je cytoszkieletu.

W oparciu o eksperymenty z naprężeniem podłoża, test manipulacji mikroigłami wykazuje, że zaburzenie sprzężenia cyto-jądrowego powoduje defekty w przekazywaniu sił wewnątrzkomórkowych. Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aspiracja mikropipetą izolowanych jąder, jest to, że umożliwiają one pomiary mechaniki jądra w nienaruszonych, żywych komórkach, bez zakłócania normalnej architektury komórkowej. Metody te mogą dostarczyć wiedzy na temat tego, jak zmiany w składzie otoczki jądrowej mogą wpływać na właściwości mechaniczne jądra.

Można je również zastosować do badania roli mechaniki jądra komórkowego w kontekście chorób, takich jak neuropatie LA lub nowotwory. Każda szalka do rozciągania składa się z wykonanej na zamówienie plastikowej szalki bez dna o średnicy trzech cali oraz plastikowej uszczelki typu O-ring do utrzymania membrany silikonowej, która służy jako podłoże do hodowli komórek. Aby przygotować szalkę do rozciągania, należy zaciisnąć kawałek membrany silikonowej o wymiarach czterech na cztery cale pomiędzy uszczelką a szalką, ostrożnie odciąć nadmiar membrany, wypłukać szalkę wodą dejonizowaną, a następnie poddać szalkę autoklawowaniu przed pokryciem membrany silikonowej cząsteczkami macierzy zewnątrzkomórkowej; na zewnętrznej stronie membrany, na środku u dołu, należy zaznaczyć punkt odniesienia.

Punkt orientacyjny ten pomoże zidentyfikować te same komórki podczas eksperymentów z odkształceniem w celu zastosowania odkształcenia jednowymiarowego. Dwa równoległe paski taśmy klejącej są nakładane wokół punktu odniesienia, aby ograniczyć formowanie się membrany w jednym wymiarze. W celu zapewnienia optymalnej adhezji komórek należy pokryć membrany silikonowe fibronektyną w stężeniu 3 µg/mL lub wszelkimi odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej.

Przykryj naczynie z sitkiem odwróconym naczyniem polistyrenowym o średnicy 10 centymetrów i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj membranę raz buforem PBS, aby usunąć nadmiar białka. Nalej do naczynia 10 mililitrów pożywki wzrostowej i odstaw.

Po przygotowaniu pokrytej membrany silikonowej w płytce, komórki odpompowuje się trypsyną 0,05% i wysiewa komórki adherentne na płytkę w pożywce wzrostowej. Procedura ta została zademonstrowana na komórkach embrionalnych myszy.

Fibroblasty lub mes inkubuje się przez 24 do 48 godzin w normalnych warunkach hodowli. Odwrócony mikroskop przystosowany do eksperymentów nad odkształceniem podłoża obejmuje urządzenie do rozciągania, składające się z płyty podstawowej pasującej do stolika mikroskopu. Płyta ta podtrzymuje centralną cylindryczną platynę, która służy do wywierania naprężeń w centralnej sekcji membrany silikonowej.

Urządzenie posiada również ruchomą płytkę, która trzyma naczynie do rozciągania i może przesuwać się w górę i w dół na czterech prowadzeniach, a także obciążnik o masie five pound do aplikowania obciążenia. Aby zwizualizować jądra komórkowe, inkubuj komórki w naczyniu do rozciągania z użyciem 1 µg/mL barwnika Hoechst przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessaj medium i zastąp je 15 mL medium wzrostowego bez czerwieni fenolowej z dodatkiem 25 mM HEPES.

Następnie wkręć szalkę do uchwytu na szalkę i ostrożnie nałóż smar na obwód dolnej części membrany silikonowej, aby zapewnić poślizg membrany wzdłuż centralnej płytki platynowej. Upewnij się, że środkowa sekcja membrany pozostaje czysta. Umieść płytkę podstawową na stole mikroskopu i ostrożnie zamontuj uchwyt na szalkę na płytce podstawowej.

Upewnij się, że w początkowej pozycji spoczynkowej silikonowa membrana naczynia do rozciągania luźno opiera się na centralnej platformie. Następnie ustaw ostrość na dno silikonowej membrany i odnaleź centralną, czarną kropkę referencyjną. Kropka ta będzie służyć jako punkt wyjścia dla wszystkich procesów akwizycji obrazów i pomoże w lokalizacji tych samych komórek w trakcie oraz po rozciąganiu.

Na tym obrazie centralna kropka wypełnia całe pole widzenia. Zaczynając od krawędzi kropki, należy dostroić ostrość, aby zwizualizować komórki oraz górną powierzchnię membrany silikonowej. Należy zlokalizować dobrze rozprzestrzenione komórki z centralnie położonymi jądrami.

Należy uzyskać obraz w kontraście fazowym, koncentrując się na zarysie komórki oraz membranie silikonowej. Następnie należy wykonać obraz fluorescencyjny barwienia haczyka jądrowego (nu nuclear hook stain), koncentrując się na płaszczyźnie środkowej jądra. Po uzyskaniu obrazów od pięciu do 15 komórek należy powrócić do centralnego punktu.

Powoli przyłóż obciążenie do naczynia do rozciągania, aby zapewnić równomierne przyłożenie odkształcenia. W centrum naczynia. Maksymalne przyłożone odkształcenie podłoża jest ograniczone przez nylonowe dystanse umieszczone na pinach wyrównujących pionowo; po przyłożeniu odkształcenia ustaw ostrość na dnie membrany silikonowej i ponownie zlokalizuj punkt odniesienia, zaczynając od tego punktu.

Przenieś te same komórki i ponownie wykonaj obraz w kontraście fazowym oraz końcowy obraz fluorescencyjny jądra każdej komórki przy pełnym odkształceniu, starając się jak najdokładniej dopasować płaszczyzny ogniskowania do obrazów początkowych. Proces ten nie powinien trwać dłużej niż 10 minut, aby uniknąć aktywnego przebudowywania i adaptacji komórki do obcego podłoża. Po wykonaniu wszystkich odpowiadających sobie obrazów, przesuń stolik mikroskopu z powrotem do punktu wyjścia.

Ostrożnie zdejmij obciążnik z płyty uchwytu naczynia i w razie potrzeby pozwól membranie silikonowej powrócić do stanu pierwotnego. Delikatnie przesuń naczynie do odwirowania w górę, aż znajdzie się w pozycji początkowej. Następnie ustaw kontrast fazowy i fluorescencję.

Obrazy komórek po odkształceniu, wykonane zgodnie z opisem obrazowania w trakcie odkształcania, a także obrazy komórek i jądra komórkowych znakowanych fluorescencyjnie przed, w trakcie i po przyłożeniu odkształcenia, są analizowane w celu obliczenia znormalizowanego odkształcenia jądra. W niniejszej demonstracji do analizy wykorzystano napisany na zamówienie skrypt MATLAB, jednak dostępne są alternatywne opcje umożliwiające ręczne obliczenie przyłożonego odkształcenia podłoża poprzez dopasowanie pozycji od trzech do sześciu punktów kontrolnych znajdujących się na membranie pomiędzy odpowiadającymi sobie obrazami sprzed i po pełnym odkształceniu. Program MATLAB oblicza następnie przyłożone odkształcenie membrany, porównując pozycje dopasowanych punktów kontrolnych na obrazach przed odkształceniem i przy pełnym odkształceniu.

Porównuje się również położenia w celu wyznaczenia odkształcenia resztkowego między obrazami sprzed i po przyłożeniu odkształcenia. Punkty kontrolne służą jednocześnie do rejestracji par obrazów, co ułatwia wykrycie uszkodzonych lub odrywających się komórek. Następnie należy ręcznie wybrać jądra komórkowe, korzystając z oddzielnego programu MATLAB, który oblicza odkształcenie jądra dla każdego pojedynczego jądra.

Osiąga się to poprzez dopasowanie rozmiaru jądra między odpowiadającymi sobie obrazami fluorescencyjnymi przed i po przyłożeniu odkształcenia lub poprzez dopasowanie markerów wewnątrzjądrowych, aby uwzględnić niewielkie różnice w przyłożonym odkształceniu błony pomiędzy różnymi eksperymentami. Wyniki są przedstawione jako znormalizowane odkształcenie jądra. Definiuje się je jako stosunek wywołanego odkształcenia jądra do przyłożonego odkształcenia błony, obliczony dla każdego jądra.

Skrypty MATLAB są dostępne w laboratorium lambing na zapytanie. Jako końcowy etap, każde jądro komórkowe jest walidowane, a pomiary z komórek, które oderwały się lub uległy uszkodzeniu podczas przykładania odkształcenia, są wykluczane. MEF rozprzestrzenione w dwóch oddzielnych obszarach na membranie silikonowej były obrazowane za pomocą mikroskopii kontrastowej i fluorescencyjnej przed, w trakcie i po zastosowaniu 20% jednowymiarowego odkształcenia osiowego; pokazano tutaj przykład udanego eksperymentu z poprawnymi jądrami komórkowymi z komórek, które przetrwały zastosowanie odkształcenia bez żadnych uszkodzeń ani oderwania.

W przeciwieństwie do nich, komórki przedstawione tutaj uległy skurczeniu lub częściowo oddzieliły się podczas przykładania odkształcenia i zostały wykluczone z analizy. Komórka po lewej stronie wykazuje oznaki uszkodzenia cytoszkieletu i kolapsu jądra, podczas gdy komórka po prawej stronie częściowo odłącza się i kurczy podczas przykładania odkształcenia. Może to świadczyć o zbyt dużym odkształceniu.

W tym miejscu przedstawiono analizę znormalizowanego odkształcenia jądra w panelu różnych linii komórkowych pochodzących od myszy z niedoborem laminy A/C; komórki te ektopowo eksponują pusty wektor lub laminę A typu dzikiego w porównaniu z komórkami od rodzeństwa typu dzikiego. Utrata ekspresji białek otoczki jądrowej laminy A/C skutkuje zwiększonym znormalizowanym odkształceniem jądra. Wskazuje to na zmniejszoną sztywność jądra, która może zostać częściowo lub w pełni przywrócona poprzez ponowne wprowadzenie laminy A typu dzikiego. Aby przygotować się do eksperymentu z manipulacją za pomocą mikroiły, inkubować szalkę hodowlaną z szklanym dnem o średnicy 35 mm z niskim stężeniem fibronektyny przez dwie godziny w temperaturze 37 °C; po inkubacji dwukrotnie przemyć szalkę HBSS i dodać do niej 2 mL pożywki wzrostowej.

Następnie zarodkowe fibroblasty mysie poddaje się trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiewa w pożywce wzrostowej na szalki z szklanym dnem pokryte fibronektyną w dwóch mililitrach pożywki wzrostowej. Aby uzyskać pojedyncze, przylegające komórki niekonfluencyjne, należy pozostawić komórki w inkubatorze przez noc; w celu ich zabarwienia do pożywki wzrostowej dodaje się barwnik mitochondrialny MitoTracker oraz barwnik jądrowy Hoechst. Pożywkę tę dodaje się do komórek, po czym następuje inkubacja.

Następnie należy wypłukać komórki, inkubując je w soli fizjologicznej Hanksa przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Potem do komórek dodaje się pożywkę wzrostową bez czerwieni fenolowej z 25 mM HEPES w celu obrazowania.

W celu przeprowadzenia eksperymentu z mikroi Igłą, należy umieścić wcześniej przygotowaną mikroi Igłę w mikromanipulatorze sprzężonym z mikroskopem odwróconym wyposażonym w cyfrową kamerę CCD. Skupić ostrość mikroi Igły w pobliżu pojedynczej komórki. Należy wykonać obraz pojedynczej komórki przed wprowadzeniem mikroi Igły w cytoszkielet.

W kontraście fazowym wykonaj jedno zdjęcie fluorescencyjne z barwieniem hooks 3 3, 3 4 2 oraz jedno zdjęcie fluorescencyjne z barwieniem mitochondriów przy użyciu obiektywu 60x w mikroskopie odwróconym; następnie, posługując się mikromanipulatorem, ostrożnie wprowadź mikroigłę do cytoplazmy komórki w określonej odległości od obwodu jądra i wykonaj jedno zdjęcie w kontraście fazowym, jedno zdjęcie fluorescencyjne z barwieniem hooks 3 3, 3 4, 2 oraz jedno zdjęcie fluorescencyjne z barwieniem mitochondriów. Przesuwaj mikroigłę w określonej odległości w kierunku obwodu komórki z prędkością 1 µm/s, używając komputerowo sterowanego mikromanipulatora, przy jednoczesnym automatycznym pozyskiwaniu obrazów co 10 s.

Podczas przesuwania mikroirygi do określonej odległości w kierunku peryferii komórki, mikromanipulator powinien być sterowany za pomocą komputera, aby zapewnić powtarzalność mikromanipulacji. Procedury kończą się wykonaniem obrazowania po usunięciu mikroirygi; obrazy fluorescencyjnie znakowanych struktur jądra i cytoszkieletu, pozyskane przed, w trakcie oraz po manipulacji mikroirygą, są analizowane w celu obliczenia przemieszczenia niewielkich obszarów wewnątrzkomórkowych. W niniejszej demonstracji do analizy wykorzystano specjalnie napisany skrypt w programie MATLAB, jednak dostępne są również inne opcje.

Skrypt MATLAB do pomiaru przemieszczenia generowanego przez mikroiżłkę jest dostępny w laboratorium lambing na żądanie. Program MATLAB wykorzystuje algorytm znormalizowanej korelacji wzajemnej do obliczenia przesunięcia pomiędzy pierwotną lokalizacją cech znakowanych fluorescencyjnie a ich nowo zidentyfikowaną pozycją. Przemieszczenia są następnie wyświetlane w formie map wektorowych i zapisywane jako wartości liczbowe.

Następnym krokiem jest wykorzystanie otrzymanych map wektorów przemieszczenia do wyznaczenia średnich przemieszczeń wewnątrz cytoszkieletu lub jądra komórkowego za pomocą programu matlab. Najpierw należy wybrać trzy lub więcej punktów w obrębie cytoszkieletu w miejscu przykładania odkształcenia. Na mapie wektorów przemieszczenia należy obliczyć średnią wartość liczbową, aby określić stopień odkształcenia cytoszkieletu w pobliżu miejsca aplikacji, który został wywołany podczas aplikacji mikroigiełki.

Następnie należy wybrać trzy lub więcej punktów w obrębie jądra komórkowego w pobliżu miejsca przyłożenia odkształcenia i obliczyć wartość średnią. Wartość ta reprezentuje stopień odkształcenia jądra w pobliżu miejsca aplikacji mikroiły. Stosując tę samą metodę, należy określić odkształcenie jądra i cytoszkieletu w miejscach oddalonych od punktu przyłożenia odkształcenia, wybierając odpowiednio punkty w tych obszarach.

W celu zmierzenia wewnątrzkomórkowego przekazywania sił przeprowadzono analizę manipulacji mikroiłką. Przedstawiono tutaj obrazy w kontraście fazowym oraz obrazy fluorescencyjne fibroblasta znakowanego niebieskim barwnikiem jądrowym oraz zielonym barwnikiem mitochondriów MIT tracker green. Mikroiłkę wprowadzono do cytoszkieletu w określonej odległości od jądra, a następnie przesunięto w kierunku obwodu komórki.

Przemieszczanie się mitochondriów śledzono przed, w trakcie i po obciążeniu cytoszkieletu, a następnie przemieszczenia te przedstawiono jako wektory. Każdy wektor reprezentuje przemieszczenie obliczone jako przesunięcie między pierwotną lokalizacją a nowo zidentyfikowaną pozycją. Z analizy wykluczono obszary o niskiej intensywności obrazu lub niewystarczającej teksturze.

Następnie określono ilościowo przemieszczenia cytoszkieletu i jądra w wybranych obszarach, w coraz większych odległościach od miejsca przyłożenia odkształcenia, zarówno dla fibroblastów kontrolnych, jak i fibroblastów. W komórkach z nienaruszonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym siły są przenoszone przez całą komórkę, co skutkuje indukowaną deformacją jądra i cytoszkieletu, która powoli zanika wraz z oddalaniem się od miejsca przyłożenia odkształcenia. W przeciwieństwie do nich, komórki z zaburzonym sprzężeniem jądrowo-cytoszkieletowym wykazują zlokalizowane przemieszczenie w pobliżu miejsca przyłożenia siły i jedynie niewielką indukowaną deformację w dalszych obszarach.

Porównywalne przyłożenie odkształcenia cytoszkieletu w miejscu wprowadzenia mikroiły zauważono zarówno w przypadku fibroblastów kontrolnych, jak i fibroblastów z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym. Jednakże indukowane przemieszczenie jądra i cytoszkieletu w innych obszarach było znacznie mniejsze w fibroblastach z zaburzonym sprzężeniem nukleo-cytoszkieletowym niż w komórkach kontrolnych. Zatem spadek przemieszczenia cytoszkieletu i jądra z dala od miejsca przyłożenia odkształcenia wskazuje, że wymuszona transmisja między cytoszkieletem a jądrem została zaburzona.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pomiaru mechaniki jądra komórkowego oraz wewnątrzkomórkowej transmisji sił między jądrem a cytoszkieletem. Techniki te można wykorzystać do badania wpływu mutacji w białkach otoczki jądrowej lub zmian w składzie otoczki jądrowej, które zachodzą podczas rozwoju lub w przebiegu nowotworów.