Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Aby wykryć biomarker białkowy związany z chorobą, weź płytkę do testu immunologicznego.

Płytka zawiera wstępnie napełnione matryce do separacji i układania w stosy wymagane do separacji białek na podstawie wielkości.

Załaduj białka i odczynniki do testów immunologicznych do oddzielnych studzienek na płytki.

Zainicjuj przebieg wewnątrz analizatora CEI. Wkład kapilarny w analizatorze zasysa matryce, tworząc żel w każdej kapilarze.

Następnie kapilar zasysa białka. Podczas elektroforezy białka migrują i rozdzielają się na podstawie ich masy cząsteczkowej.

Analizator wprowadza światło UV, unieruchamiając białka w naczyniach włosowatych.

Bufor płuczący usuwa matryce i niezwiązane białka. Następnie przepływa bufor blokujący, blokując niespecyficzne miejsca interakcji.

Analizator wprowadza przeciwciała pierwszorzędowe, które wiążą się z biomarkerem, a następnie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą oddziałujące z przeciwciałami pierwszorzędowymi.

Umyć, a następnie dodać substrat chemiluminescencyjny. Peroksydaza utlenia podłoże, emitując luminescencję.

Zmierz intensywność luminescencji i porównaj ją ze standardem białka do wykrywania biomarkerów.

Po zebraniu 100 mikrolitrów ludzkich lizatów płytek krwi od pacjentów z ALS i osób zdrowych, wypełnij wygenerowane przez siebie szablony do układu kapilarnego i przygotowania próbki. Tabela przygotowania mieszaniny próbek jest dynamiczna i automatycznie oblicza, ile objętości należy usunąć ze źródła. Umieścić wszystkie odczynniki do oznaczania na lodzie, z wyjątkiem standardowego opakowania, które powinno pozostać w temperaturze pokojowej.

Aby przygotować wzorcową mieszankę fluorescencyjną, dodaj 40 mikrolitrów dejonizowanej wody do przezroczystej probówki DTT i dodaj 20 mikrolitrów 10-krotnego buforu do próbek oraz 20 mikrolitrów przygotowanego 400-milimolowego roztworu DTT do różowej probówki z zestawu do testów.

Aby przygotować drabinę biotynylową, dodaj 16 mikrolitrów wody dejonizowanej, 2 mikrolitry buforu do próbek 10X i 2 mikrolitry przygotowanego 400-milimolowego roztworu DTT do białej probówki dołączonej do zestawu. Po delikatnym wymieszaniu przenieś roztwór drabinki do 200-mikrolitrowej probówki PCR przed denaturacją.

Dodaj 1,5 mikrolitra 10-krotnego buforu do próbki i 148,5 mikrolitra dejonizowanej wody do 600-mikrolitrowej probówki wirówkowej i wiruj do wymieszania, zanim umieścisz probówkę na lodzie. Dodać interesujące przeciwciała bezpośrednio do rozcieńczalnika, jak wskazano w tabeli, i kilkakrotnie przepłukać końcówkę pipety, aby uzyskać jednorodny roztwór przeciwciał.

Aby przygotować kapilarną mieszaninę próbek, otwórz wszystkie probówki do PCR i dodaj 1,6 mikrolitra porcji fluorescencyjnego buforu do próbki 5X do każdej probówki, jak wskazano w tabeli, stosując technikę odwróconego pipetowania, natychmiast zamykając każdą probówkę po dodaniu buforu. Po dodaniu całego buforu otwórz wszystkie probówki i dodaj 0,1x bufor próbki w objętościach wskazanych w tabeli, natychmiast zamykając każdą probówkę podczas dodawania buforu.

Następnie otwórz wszystkie probówki i dodaj próbki białka, jak wskazano w tabeli, i natychmiast zamknij każdą nakrętkę probówki. Po dodaniu wszystkich próbek należy na krótko odwirować wszystkie probówki w wirówce stołowej. Wirować w celu wymieszania i ponownie odwirować próbki.

Pod koniec drugiego wirowania umieść wszystkie probówki w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką i poddaj próbki denaturacji we wskazanych warunkach. Pod koniec denaturacji odwirować, wymieszać i ponownie odwirować próbki, a następnie umieścić wszystkie probówki w stojaku na probówki na lodzie.

Korzystając z rysunku jako wskazówki, dodać 10 mikrolitrów peroksydazy chrzanowej streptawidyny do studzienki D1, 10 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała wtórnego do studzienek od D2 do D5, 10 mikrolitrów rozcieńczalnika przeciwciał do każdej studzienki w rzędzie B i do studzienki C1, 10 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała pierwszorzędowego do studzienek od C2 do C25, 5 mikrolitrów biotynylowanej drabinki z probówki PCR nr 1 do studzienki A1, 3 mikrolitry próbki do rzędów od A2 do A25 i 15 mikrolitrów świeżo przygotowanego nadtlenku luminolu do każdej studzienki rzędu E.

Pipetowanie mieszanki próbek i odczynników do maleńkiego dołka we właściwej kolejności ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu, dlatego powinno być wykonywane bardzo ostrożnie.

Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania do każdej wyznaczonej studzienki buforu do płukania i odwirować zawartość płytki przez odwirowanie.