Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w określonych genach roślinnych. Podejście to łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) i ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala na wykrycie modyfikacji histonów na określonych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Poniższa metoda zapewnia niezawodne i czułe wykrywanie specyficznych modyfikacji chromatyny w wybranych genach roślinnych. Pierwsze usieciowanie zmodyfikowanych histonów i DNA z formaldehydem. Następnie ekstrahuj i sonikuj chromatynę, aby ułatwić immunoprecypitację za pomocą specyficznych przeciwciał modyfikujących.

Na koniec przeanalizuj reakcję chipa za pomocą żużlu łączącego kompleksy histonowego DNA i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym specyficznego dla genu. W przypadku roślin podejście to może dostarczyć informacji molekularnych, takich jak specyficzne modyfikacje histonów związane z fotosyntezą C-4 w labiryncie i odpornością ogólnoustrojową u Arabidopsis. Główną przewagą immunoprecypitacji chromatyny nad istniejącymi metodami, takimi jak spektrometria Marsa, jest to, że technika ta umożliwia wykrywanie modyfikacji histonów w wybranych sekwencjach w genomie rośliny.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ protokół pociąga za sobą kilka kroków, których prawidłowe wykonanie jest kluczem do sukcesu procedury. W tym filmie wykorzystujemy analizę chipów, aby zapewnić wgląd w deregulację ekspresji genów w modelowej roślinie Arabidopsis ANA demonstrując, że procedura zostanie przeprowadzona przez Mic Yakovich, doktoranta Dla każdej próbki zacznij od zbioru dwóch gramów liści rzodkiewnika i 50-mililitrowej plastikowej tuby. Napełnij znak 40 mililitrów buforem sieciującym i umieść dopasowaną gąbkę filtracyjną tuż nad powierzchnią bufora, aby upewnić się, że liście pozostaną zanurzone.

Teraz umieść próbki w osuszaczu z próżnią i filtruj przez 10 minut. Aby zatrzymać reakcję sieciowania, dodaj 2,5 mililitra dwóch molowych glicyn i wymieszaj przez inwersję. Następnie infiltruj ponownie przez pięć minut, kontynuuj odkurzanie, infiltruj przez kolejne pięć minut.

Następnie wylej płyn podczas zbierania liści na sicie. Po dwukrotnym umyciu liści jednym litrem wody w plastikowej zlewce, liście dokładnie osusz ręcznikami papierowymi, zbierz liście do świeżej plastikowej tuby i zamroź w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu wyizolowania chromatyny.

Za pomocą moździerza i tłuczka chłodzonego ciekłym azotem zmielić zamrożone próbki na drobny proszek. Przenieś proszek do 50-mililitrowej plastikowej tuby. Zawiesić proszek w 30 mililitrach buforu ekstrakcyjnego numer jeden i inkubować przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce nad głową.

Przełóż zawiesinę przez cztery warstwy tkaniny lustrzanej do świeżej 50-mililitrowej plastikowej tubki. Po odwirowaniu wyrzuć natynę SUP. Następnie za pomocą pędzla ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego numer dwa, a następnie dodać kolejne 950 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego.

Po drugie, przenieś zawiesinę do 1,5-mililitrowej mikrorurki fuge i wiruj przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj dwie mililitrowe mikroprobówki fuge zawierające 1,5 mililitra buforu ekstrakcyjnego. Numer trzy.

Następnie wyrzuć supernatanty, aby stopniowo zawiesić osad w 300 mikrolitrach buforu ekstrakcyjnego. Numer trzy. Najpierw dodaj niewielką objętość bufora.

Po trzecie, zawieś granulat za pomocą pędzla, a następnie dodaj pozostały bufor. Teraz ostrożnie ułóż próbki na przygotowanych probówkach z 1,5 mililitra buforu ekstrakcyjnego. Po trzecie, zapewnienie, że dwie fazy nie będą mieszać próbek wirówki przez godzinę w temperaturze 16 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzuć sup natin i zawieś osad chromatyny za pomocą pędzla w 300 mikrolitrach buforu sonikacyjnego, sonikuj chromatynę do wielkości DNA około 400 par zasad. Podczas sonizacji upewnij się, że chromatyna nie zostanie podgrzana powyżej około 30 stopni Celsjusza. Aby chronić wrażliwe na ciepło wiązania krzyżowe, należy odwirować próbkę sonikacyjną w celu wytrącenia nierozpuszczonego materiału i zebrać supernatant do dwóch mililitrowych mikroprobówek mikro fuge zawierających białko agarozę i bufor wiążący przeciwciało.

Dodać 200 mikrolitrów preparatu chromatyny próbki. Inkubować probówki przez godzinę na wytrząsarce nad głową. Po odwirowaniu zebrać supernatanty próbki i podwielokrotność 30 mikrolitrów białka.

A aros do świeżych 1,5 mililitrowych probówek do oznaczania stężenia chromatyny w materiale wejściowym. Zarezerwuj 40 mikrolitrów sonikowanej chromatyny. Następnie dodać 400 mikrolitrów sonikowanej zawiesiny chromatyny do 30 mikrolitrów białka aros i odpowiednią ilość przeciwciała specyficznego dla modyfikacji inkubować przez noc na wytrząsarce nad głową w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zbierać kulki przez dwie minuty w temperaturze 440 razy G. Usunąć supernatant i przeprowadzić kolejne 10-minutowe płukanie granulek kulek 900 mikrolitrami odpowiedniego buforu na wytrząsarce nad głową. Po ostatnim umyciu całkowicie usuń pozostały bufor. Aby uwolnić DNA z histonów, dodaj 400 mikrolitrów buforu sieciującego D do kulek i 40 mikrolitrów próbki wejściowej zakonserwowanej wcześniej wiruj przez pięć minut, odwiruj próbki i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc.

Teraz oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA i wykonaj konwencjonalne ilościowe R-T-P-C-R specyficzne dla locus w czasie rzeczywistym. W tym przykładzie ekspresja dwugenowego genu obronnego Arabidopsis ANA PR została wywołana przez Benzo Diaz ole, syntetyczny analog hormonu roślinnego, kwasu salicylowego. Wyniki pokazują, że aktywacja ekspresji PR dwa jest związana ze wzrostem acetylacji reszt lizyny na histonach H 3 i H 4 na promotorze PR dwa.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dodanie buforu ekstrakcyjnego jeden do proszku liściowego powoduje nadmierne ciśnienie w zamkniętej rurce fcon. Pamiętaj, aby raz na jakiś czas otworzyć tubkę. Należy również pamiętać, aby nie usuwać pędzla po zawieszeniu granulatu przed dodaniem kolejnego bufora.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić modyfikacje jego onu i zwykłe dźwignie, w których tworzą sieciowanie DNA i histonów na podstawie aldehydu, izolację immunoprecypitacji chromatyny i kwantyfikację DNA specyficznego dla locus, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli chromatyny i jej modyfikacji w różnych dziedzinach biologii roślin.