Name: Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę wykrywania modyfikacji histonów w liściach roślin za pomocą chromatynowej immunoprecypitacji i PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala badać regulację ekspresji genów u Arabidopsis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content">Niniejsza praca została sfinansowana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) oraz Inicjatywę Doskonałości rządu federalnego i rządów krajowych Niemiec.</p>


<p class="jove_title">1. Sieciowanie materiału roślinnego</p>
<ol>
 <li>Zebrać 1-2g liści Arabidopsis (średnica rozety od 6 do 10cm) do plastikowej probówki o pojemności 50ml i dopełnić do 40mL buforem sieciującym. </li>
 <li>Upewnić się, że liście pozostają zanurzone, np. poprzez umieszczenie dopasowanej gąbki filtracyjnej bezpośrednio nad powierzchnią buforu. Następnie umieścić probówki w eksyكاتهrze.</li>
 <li>Przeprowadzić infiltrację próżniową przez 10min. Do każdej probówki dodać 2,5mL 2M glicyny w celu zatrzymania sieciowania, a następnie odwrócić probówki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie glicyny.</li>
 <li>Ponownie przeprowadzić infiltrację próżniową przez kolejne 5min, a następnie odlać ciecz, zbierając liście na sicie.</li>
 <li>Przemyć liście dwukrotnie 1L wody w zlewce szklanej, a następnie dokładnie osuszyć liście ręcznikami papierowymi.</li>
 <li>Zebrać liście do nowej plastikowej probówki i zamrozić w ciekłym azocie. Przechowywać liście w temperaturze -80° C do czasu izolacji chromatyny.</li>
</ol>
<p class="jove_title">2. Izolacja chromatyny</p>
<ol>
 <li>Liście ucierano w moździerzu z tłuczkiem, które do momentu użycia przechowywano w ciekłym azocie.</li>
 <li>Przenieść proszek do plastikowej probówki o pojemności 50 mL i zawiesić w 30 mL buforu ekstrakcyjnego nr 1.</li>
 <li>Inkubować przez 15 min w temperaturze 4°C na wytrząsarce nadstawkowej.</li>
 <li>Przefiltrować zawiesinę przez cztery warstwy tkaniny miracloth do nowej plastikowej probówki o pojemności 50 mL.</li>
 <li>Wirować przez 20 min przy 2 800 x g w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad za pomocą pędzla w 1 mL buforu ekstrakcyjnego nr 2. Najpierw dodać niewielką objętość buforu nr 2, następnie zawiesić osad pędzlem, a potem dodać resztę buforu.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i wirować przez 10 min przy 12 000 x g w temperaturze 4°C.</li>
 <li>W międzyczasie przygotować probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL zawierające 1,5 mL buforu ekstrakcyjnego nr 3.</li>
 <li>Usunąć nadsącz z wirowanej probówki (krok 2.7) i zawiesić osad w 300 μL buforu ekstrakcyjnego nr 3. Najpierw dodać niewielką objętość buforu nr 3, zawiesić osad pędzlem, a następnie dodać pozostałą część buforu.</li>
 <li>Ostrożnie nanieść pipetą zawiesinę osadu (krok 2.9) na powierzchnię 1,5 mL buforu ekstrakcyjnego nr 3 przygotowanego w kroku 2.8. Należy upewnić się, że dwie fazy nie zmieszają się. Wirować przez 1 h przy 16 000 x g w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i zawiesić osad chromatyny za pomocą pędzla w 300 μL buforu do sonikacji.</li>
 <li>Sonikować chromatynę za pomocą sonotrody lub w kąpieli ultradźwiękowej do uzyskania wielkości DNA wynoszącej około 400 bp. Podczas sonikacji należy dopilnować, aby chromatyna nie nagrzała się powyżej około 30 °C, aby chronić wrażliwe na ciepło wiązania krzyżowe. Czas trwania sonikacji musi zostać ustalony eksperymentalnie, ponieważ różni się on znacznie w zależności od urządzenia. Jako wskazówkę podano ustawienia dla dwóch różnych urządzeń: </li>
</ol>
<p class="jove_content">W celu sonikacji przy użyciu sonotrody marki Bandelin, poddaj chromatynę w probówce mikrotubkowej 0,6mL pięciokrotnie 20 impulsom przy ustawieniach mocy 25% oraz cyklu = 50. W trakcie tego procesu chłodź próbkę w łaźni lodowej po każdym 20<sup>tym</sup> impulsie.</p>
<p class="jove_content">W przypadku sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej Diagenode Bioruptor, należy napełnić kąpiel wodą i lodem, a następnie sonikować próbki w probówkach mikrocentryfużowych o pojemności 1.5mL dziesięciokrotnie przez 30 sekund przy ustawieniu „high”. Po każdych 30 sekundach należy chłodzić próbki przez kolejne 30 sekund.</p>
<ol start="13"><li>Wiruj sonikowaną próbkę przez 5min przy 16,000g w temperaturze 4°C, aby wytrącić nierozpuszczony materiał. Nadnadłoś mogą bezpośrednio wykorzystać do immunoprecypitacji. Alternatywnie próbki można zamrozić szokowo w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.</li></ol>
<p class="jove_title">3. Immunoprecypitacja</p>
<ol>
 <li>Przygotować probówki do wirówki o objętości 2 mL zawierające 40μL agarozy z białkiem A oraz 1,8mL buforu do wiązania przeciwciał. Dodać 200μL preparatu chromatyny (krok 2.13).</li>
 <li>Inkubować probówki przez 1h na wytrząsarce orbitalnej.</li>
 <li>Odseparować kuleczki agarozy z białkiem A i wykorzystać nadsącz do immunoprecypitacji.</li>
 <li>Pobrać alikwot 40μL w celu oznaczenia stężenia chromatyny („input”).</li>
 <li>Do 400μL sonikowanej zawiesiny chromatyny dodać 30μL agarozy z białkiem A oraz ilość przeciwciała specyficznego dla modyfikacji wskazaną w poniższej tabeli odczynników i sprzętu.</li>
 <li>Inkubować przez 2,5h lub przez noc na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Odwirować kuleczki przez 2min przy 440 x g.</li>
 <li>Przemyć osad z kuleczek za pomocą 900μL każdego z buforów do przemywania (patrz lista poniżej). Dla każdego buforu inkubować kuleczki w buforze przez 10min na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 4°C, następnie wirować przez 2min przy 440 x g, odlać nadsącz i dodać kolejny bufor.
<ol>
<li>Bufor do przemywania o niskim zasoleniu</li>
<li>Bufor do przemywania o wysokim zasoleniu</li>
<li>Bufor do przemywania LiCl</li>
<li>Bufor do przemywania TE</li>
</ol></li>
 <li>Po ostatnim przemywaniu całkowicie usunąć pozostały bufor.</li>
</ol>
<p class="jove_title">4. Odwiązanie wiązań krzyżowych histonów i DNA oraz oczyszczanie wytrąconego DNA</p>
<ol>
 <li>Do osadu agarozy oraz do 40μl próbki „input” z kroku 3.4 dodać 100μL buforu do odkrzyżowania, mieszać przez 5min na wstrząsarce wortex, odwirować próbki i inkubować w temperaturze 65°C przez noc.</li>
 <li>Oczyścić DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA lub PCR.</li>
 <li>Zazwyczaj 5μl rozcieńczenia 1:5 końcowego eluatu z kolumny jest wystarczające do przeprowadzenia standardowej ilościowej analizy RT-PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) specyficznej dla konkretnego locus.</li>
</ol>
<p class="jove_title">5. Tabela buforów</p>
<table border="1">
 <tbody >
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do sieciowania</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Maślan sodu</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sacharoza</td>
   <td>400mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-merkaptoetanol</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Formaldehyd</td>
   <td>3% (v/v) </td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do ekstrakcji nr 1</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Maślan sodu</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sacharoza</td>
   <td>400mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-merkaptoetanol</td>
   <td>5mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Kompletny inhibitor proteaz</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do ekstrakcji nr 2</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Maślan sodu</td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sacharoza</td>
   <td>250 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8,0</td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-merkaptoetanol</td>
   <td>5 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>MgCl2<sub>2</sub></td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (m/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Kompletny inhibitor proteaz</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do ekstrakcji nr 3</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Maślan sodu</td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Sacharoza</td>
   <td>1,7 M</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8,0</td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>β-merkaptoetanol</td>
   <td>5 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>MgCl2<sub>2</sub></td>
   <td>2 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>0,15% (m/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Kompletny inhibitor proteaz</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do sonikacji</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8,0</td>
   <td>25 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8,0</td>
   <td>5 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Karta charakterystyki bezpieczeństwa</td>
   <td>0,5% (m/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Kompletny inhibitor proteaz</td>
   <td>1x</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do wiązania przeciwciał</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>50mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>1mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>150mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor płuczący o niskim stężeniu soli</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>150mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>2mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody >
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do płukania o wysokim stężeniu soli</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>500mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>SDS</td>
   <td>0.1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Triton X-100</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>2mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td colspan="2"><strong>Bufor do płukania LiCl</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Chlorek litu</td>
   <td>250mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Nonidet-P40</td>
   <td>1% (v/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Deoksycholan sodu</td>
   <td>1% (w/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>1mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>20mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td><strong>Bufor płuczący TE</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>EDTA-NaOH, pH 8.0</td>
   <td>10mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 8.0</td>
   <td>1mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<table border="1">
 <tbody>
  <tr>
   <td><strong>Bufor do usuwania wiązań krzyżowych</strong></td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Tris-HCl, pH 6,8</td>
   <td>62,5 mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>NaCl</td>
   <td>200mM</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>Karta charakterystyki bezpieczeństwa (SDS)</td>
   <td>2% (m/v)</td>
  </tr>
  <tr>
   <td>DTT</td>
   <td>10 mM</td>
  </tr>
 </tbody>
</table>
<p class="jove_title">6. Reprezentatywne wyniki:  </p>
<p class="jove_content">Ekspresja genu obronnego <em>Arabidopsis thaliana PR2</em>, kodującego β-1,3-glukanazę o działaniu przeciwdrobnoustrojowym<sup>12</sup>, została indukowana przez benzotiazodiazol (BTH), syntetyczny analog hormonu roślinnego kwasu salicylowego<sup>3</sup>. <strong>Rysunek 1</strong> wykazuje, że aktywacja ekspresji <em>PR2</em> wiąże się ze zwiększeniem acetylacji reszt lizyny w histonach H3 i H4 w obrębie promotora <em>PR2</em>. Ponieważ gęstość nukleosomów maleje podczas aktywacji genu<sup>13</sup>, wartości acetylacji histonów znormalizowano względem sygnału uzyskanego przy użyciu przeciwciała przeciwko niezmiennemu regionowi histonu 3.</p>
<p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/3096/3096fig1.jpg" alt="Wykres słupkowy przedstawiający krotność wzrostu acetylacji histonów (H4K5ac-H3K9ac) w odpowiedzi na traktowanie BTH." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"><br><strong>Rysunek 1 BTH indukuje acetylację histonów w promotorze <em>PR2</em> u Arabidopsis</strong>. Rośliny traktowano 100μM BTH lub kontrolą w postaci proszku zmywalnego. Po 72h zebrano liście i wyizolowano chromatynę. Sygnał uzyskany po precypitacji z przeciwciałami specyficznymi dla acetylacji (zgodnie z oznaczeniem na rysunku) znormalizowano względem sygnału uzyskanego po precypitacji z przeciwciałem przeciwko niezmiennym domenom histonu H3. Ilość precypitowanej chromatyny oznaczono metodą RT-qPCR. Dane zostały zestandaryzowane względem poziomów modyfikacji histonów w przypadku braku traktowania BTH.</p>

<ol><li>Eberharter, A., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation%3A+a+switch+between+repressive+and+permissive+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>3</strong>, 224-229 (2002).</li>
<li>Ruthenburg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+lysine+4+on+histone+H3%3A+intricacy+of+writing+and+reading+a+single+epigenetic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic.</a> <strong>25</strong>, 15-30 (2007).</li>
<li>Jaskiewicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+acts+as+a+memory+for+systemic+acquired+resistance+in+the+plant+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+rep%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response.</a> <em>EMBO rep</em>. <strong>12</strong>, 50-55 (2011).</li>
<li>Ng, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+histone+modifications+are+associated+with+transcriptional+poising+and+activation+of+the+phaseolin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 119-132 (2006).</li>
<li>Offermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumination+is+necessary+and+sufficient+to+induce+histone+acetylation+independent+of+transcriptional+activity+at+the+C4-specific+phosphoenolpyruvate+carboxylase+promoter+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>141</strong>, 1078-1088 (2006).</li>
<li>Deng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+histone+acetyltransferase+AtHAC1+in+the+regulation+of+flowering+time+via+repression+of+FLOWERING+LOCUS+C+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis.</a> <em>Plant Physiol</em>. <strong>143</strong>, 1660-1668 (2007).</li>
<li>Benhamed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+GCN5%2C+HD1%2C+and+TAF1%2FHAF2+interact+to+regulate+histone+acetylation+required+for+light-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>18</strong>, 2893-2903 (2006).</li>
<li>Bowler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+techniques+for+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Chromatin techniques for plant cells.</a> <em>Plant Journal</em>. <strong>39</strong>, 776-789 (2004).</li>
<li>Orlando, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+chromosomal+proteins+in+vivo+by+formaldehyde+decrosslinked-chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation.</a> <em>Trends Biochem. Sci</em>. <strong>25</strong>, 99-104 (2000).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Meth%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> <em>Plant Meth</em>. <strong>3</strong>, 11-11 (2007).</li>
<li>Danker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+information+but+not+promoter+activity+controls+the+methylation+state+of+histone+H3+lysine+4+on+two+photosynthetic+genes+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize.</a> <em>Plant J</em>. <strong>53</strong>, 465-474 (2008).</li>
<li>Uknes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Acquired resistance in Arabidopsis.</a> <em>Plant Cell</em>. <strong>4</strong>, 645-656 (1992).</li>
<li>Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+displacement+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Develop%22%5BJournal%5D)">Nucleosome displacement in transcription.</a> <em>Genes Develop</em>. <strong>20</strong>, 2009-2017 (2006).</li>
</ol>

<p class="jove_content">Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.</p>

<p class="jove_content">Kluczowymi etapami protokołu są sieciowanie DNA i histonów, rodzaj i ilość materiału liściowego, rozcieranie materiału oraz sonikacja chromatyny. Bardziej szczegółową dyskusję na ten temat można znaleźć w ref. 9 i 10.</p>
<p class="jove_step">Sonikacja i sieciowanie: </p>
<p class="jove_content">Ważne jest, aby podczas sonikacji rozbić chromatynę na fragmenty o długości około 400bp. Zbyt intensywna sonikacja doprowadzi do zniszczenia chromatyny poprzez degradację DNA i histonów, natomiast niewystarczająca sonikacja pozostawi długie fragmenty chromatyny. Wpływa to na swoistość metody, ponieważ modyfikacje histonów oddalonych od badanego locus nie mogą zostać odróżnione od modyfikacji lokalnych. Wydajność sonikacji najlepiej sprawdzić, pobierając 20μL chromatyny z próbek przed i po sonikacji, odwracając wiązania krzyżowe DNA i histonów, izolując DNA i określając długość pociętego DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Przed elektroforezą do próbek należy dodać RNAzę, ponieważ na tym etapie oczyszczania preparat chromatyny wciąż zawiera duże ilości RNA, które mogą utrudniać wizualizację pofragmentowanego DNA. Próbki nadają się do immunoprecypitacji chromatyny, jeśli DNA z niesonikowanej chromatyny jest dłuższe niż 10kbp, natomiast DNA z sonikowanej chromatyny tworzy rozmycie (smear) z maksymalną intensywnością sygnału wokół 400bp DNA.</p>
<p class="jove_content">Do sieciowania chromatyny w nienaruszonych liściach rutynowo stosujemy 3% (v/v) formaldehyd, jednak w większości przypadków wystarczające może być stężenie 1% (v/v). W naszych doświadczeniach niskie stężenia formaldehydu pozwalają na skrócenie czasu sonikacji oraz zmniejszenie sygnałów tła w następujących po niej reakcjach PCR. Jednak zbyt mała ilość formaldehydu często skutkuje niską powtarzalnością sygnału PCR pomiędzy niezależnymi eksperymentami. Może to wynikać z niewystarczającej penetracji liści przez formaldehyd przy niskich stężeniach. Należy pamiętać o częstej wymianie roztworu stokowego formaldehydu, ponieważ związek ten ma tendencję do polimeryzacji wraz z upływem czasu. Roztwory formaldehydu są stabilne jedynie przez około jeden miesiąc, a okres ten jest w niewielkim stopniu wydłużany przez stabilizację metanolem. Przy ustalaniu warunków eksperymentalnych zaleca się przetestowanie różnych stężeń formaldehydu. </p>
<p class="jove_step">Ilość materiału roślinnego i mielenie: </p>
<p class="jove_content">Ważne jest, aby infiltrować niewielkie ilości materiału liściowego w dużej objętości buforu, aby zapobiec sklejaniu się liści. Sklejanie się liści często prowadzi do niewystarczającej infiltracji formaldehydu. Ponadto zbyt duża ilość materiału roślinnego może zablokować pory tkaniny Miracloth. Efektywność mielenia w znacznym stopniu zależy od zastosowania moździerza z dopasowanym tłuczkiem. Rutynowo mielimy materiał za pomocą schłodzonego ciekłym azotem tłuczka i moździerza, bez dodawania dodatkowego ciekłego azotu, trzykrotnie przez 50 sekund, aż materiał zostanie zmielony na drobny proszek.</p>


<table><tbody><tr><td>Agaroza z białkiem A</td><td>Roche Group</td><td>11 134 515 001</td><td>zależnie od klasy przeciwciał</td></tr><tr><td>Agaroza z białkiem G</td><td>Roche Group</td><td>11 243 233 001</td><td>zależnie od klasy przeciwciał</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-hyperacetyl-H4</td><td>EMD Millipore</td><td>06-946</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H4K5</td><td>EMD Millipore</td><td>07-327</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H4K8</td><td>EMD Millipore</td><td>07-328</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H4K12</td><td>EMD Millipore</td><td>07-595</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H4K16</td><td>EMD Millipore</td><td>07-329</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H4K18</td><td>EMD Millipore</td><td>07-354</td><td>użyto 1&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H3K9</td><td>EMD Millipore</td><td>07-352</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-acetyl-H3K14</td><td>EMD Millipore</td><td>07-353</td><td>użyto 1&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-trimethyl-H3K4</td><td>Diagenode</td><td>pAB-003-50</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-dimethyl-H3K4</td><td>EMD Millipore</td><td>07-030</td><td>użyto 5&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-monomethyl-H3K4</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td>2,5 - 10&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>użyto 1&amp;#x03BC;L do sprawdzenia gęstości histonów</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TO</td><td></td></tr><tr><td>Sonotroda MS72</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteaz</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

<p class="jove_content">Struktura chromatyny ma kluczowe znaczenie dla regulacji ekspresji genów u eukariotów. W procesie tym istotną rolę odgrywają przebudowa chromatyny, metylacja DNA oraz kowalencyjne modyfikacje aminowych końców N histonów H3 i H4<sup>1-2</sup>. Modyfikacje histonów H3 i H4 obejmują metylację lizyny i argininy, acetylację lizyny oraz fosforylację reszt seryny<sup>1-2</sup>. Modyfikacje te wiążą się z aktywacją genu, jego represją lub stanem przygotowania genu, który umożliwia szybszą i silniejszą aktywację ekspresji po odebraniu odpowiednich sygnałów (np. wzorców molekularnych związanych z drobnoustrojami, światła, hormonów)<sup>3-7</sup>.</p>
<p class="jove_content">W niniejszej pracy przedstawiamy metodę niezawodnego i czułego wykrywania specyficznych modyfikacji chromatyny w wybranych genach roślin. Technika ta opiera się na sieciowaniu (zmodyfikowanych) histonów i DNA przy użyciu formaldehydu<sup>8,9</sup>, ekstrakcji i sonikacji chromatyny, immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danej modyfikacji<sup>9,10</sup>, odsieciowaniu kompleksów histon-DNA oraz genowo-specyficznej ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Podejście to okazało się użyteczne w wykrywaniu specyficznych modyfikacji histonów związanych z fotosyntezą C<sub>4</sub> u kukurydzy<sup>5,11</sup> oraz z odpornością systemową u Arabidopsis<sup>3</sup>.</p>


<p class="jove_content">Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.</p>

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Struktura chromatyny ma istotne znaczenie dla regulacji ekspresji genów u eukariotów. W procesie tym przebudowa chromatyny, metylacja DNA oraz kowalencyjne...

<p>Poniższa metoda umożliwia niezawodną i czułą detekcję specyficznych modyfikacji chromatyny w wybranych genach roślinnych. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić sieciowanie zmodyfikowanych histonów i DNA przy użyciu formaldehydu. Następnie należy wyekstrahować i poddać sonikacji chromatynę, aby ułatwić immunoprecypitację z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla danej modyfikacji.</p><p>Na koniec przeanalizuj reakcję ChIP poprzez wiązanie krzyżowe kompleksów histon-DNA oraz genowo-specyficzną ilościową PCR w czasie rzeczywistym. U roślin podejście to może dostarczyć informacji molekularnych, takich jak specyficzne modyfikacje histonów związane z fotosyntezą typu C4 u kukurydzy i odpornością systemową u Arabidopsis. Główną zaletą immunoprecypitacji chromatyny w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak spektrometria mas, jest fakt, że technika ta umożliwia wykrycie modyfikacji histonów w wybranych sekwencjach w genomie rośliny.</p><p>Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ protokół obejmuje kilka etapów, których prawidłowe wykonanie jest kluczowe dla sukcesu procedury. W tym filmie wykorzystujemy analizę ChIP, aby przybliżyć deregulację ekspresji genów u rośliny modelowej Arabidopsis, a procedurę demonstruje Mic Yakovich, doktorant. Dla każdej próbki należy rozpocząć od zebrania 2 g liści arabidopsis i przygotowania plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Napełnić probówkę buforem do sieciowania do poziomu 40 ml i umieścić dopasowaną gąbkę filtrującą bezpośrednio nad powierzchnią buforu, aby zapewnić całkowite zanurzenie liści.</p><p>Następnie umieść próbki w eksykatorze próżniowym i poddaj filtracji przez 10 minut. Aby zatrzymać reakcję sieciowania, dodaj 2,5 milliliters dwumolowej glicyny i wymieszaj metodą odwracania. Następnie ponownie poddaj infiltracji przez pięć minut, kontynuując odsysanie próżniowe, a potem infiltruj przez kolejne pięć minut.</p><p>Następnie odlej ciecz, zbierając liście na sicie. Po dwukrotnym przemyciu liści jednym litrem wody w plastikowym zlewce, dokładnie osusz je ręcznikami papierowymi, umieść w nowej plastikowej probówce i zamroź w ciekłym azocie. Próbki przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu izolacji chromatyny.</p><p>Używając moździerza i tłuczka chłodzonych ciekłym azotem, rozetrzeć zamrożone próbki na drobny proszek. Przenieść proszek do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Zawiesić proszek w 30 ml buforu do ekstrakcji nr 1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce nadstawkowej.</p><p>Przenieść zawiesinę przez cztery warstwy tkaniny lustrzanej do nowej plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Po wirowaniu odrzucić nadsącz. Następnie, używając pędzla, resuspender osad w 50 µL buforu ekstrakcyjnego nr 2, a następnie dodać kolejne 950 µL buforu ekstrakcyjnego.</p><p>Po drugie, przenieść zawiesinę do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 minut. W międzyczasie przygotować probówki do wirówki o pojemności 2 ml zawierające 1,5 ml buforu do ekstrakcji. Po trzecie.</p><p>Następnie odlej ciecze nadsączowe, aby stopniowo zawiesić osad w 300 µL buforu do ekstrakcji. Numer trzy. Najpierw dodaj niewielką objętość buforu.</p><p>Po trzecie, resuspenduj osad za pomocą pędzelka, a następnie dodaj pozostały bufor. Teraz ostrożnie nanieś próbki na przygotowane probówki zawierające 1,5 mililitra buforu do ekstrakcji. Po trzecie, upewniając się, że dwie fazy nie zmieszają się, odwiruj próbki przez jedną godzinę przy 16 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.</p><p>Odlej nadsącz i zawiesić osad chromatyny za pomocą pędzla w 300 µL buforu do sonikacji, a następnie poddać chromatynę sonikacji do uzyskania wielkości DNA wynoszącej około 400 par zasad. Podczas sonikacji należy dopilnować, aby chromatyna nie została podgrzana powyżej około 30 °C. W celu ochrony wrażliwych na ciepło wiązań sieciowych, odwiruj próbkę po sonikacji, aby wytrącić nierozpuszczony materiał, a następnie przenieś nadsącz do probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 mL zawierających agarozę białkową oraz bufor wiążący przeciwciała.</p><p>Dodaj 200 µL preparatu chromatyny z próbki. Inkubuj probówki przez jedną godzinę na wytrząsarce nadstawkowej. Po wirowaniu pobierz nadsączki z próbek i odnieś aalikwoty białka o objętości 30 µL.</p><p>Przenieś alikwoty do nowych probówek o pojemności 1,5 ml w celu oznaczenia stężenia chromatyny materiału wejściowego. Odstaw 40 µl sonikowanej chromatyny. Następnie dodaj 400 µl zawiesiny sonikowanej chromatyny do 30 µl alikwotów białek oraz odpowiedniej ilości przeciwciała specyficznego dla modyfikacji i inkubuj przez noc na wytrząsarce w temperaturze 4 °C.</p><p>Osadź kuleczki poprzez wirowanie przez dwie minuty przy 440 ×g. Usuń nadsącz i przeprowadź kolejne 10-minutowe płukania osadów z kuleczek 900 µL odpowiedniego buforu na wytrząsaczu nadstawkowym. Po ostatnim płukaniu całkowicie usuń pozostały bufor. Aby uwolnić DNA z histonów, dodaj do kuleczek 400 µL buforu do rozszczepiania wiązań krzyżowych (D cross linking buffer) oraz wcześniej zachowaną 40 µL próbkę wejściową, wierzchołkuj przez pięć minut, odwiruj próbki i inkubuj w temperaturze 65 °C przez noc.</p><p>Następnie oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA i przeprowadź konwencjonalną ilościową reakcję R-T-P-C-R w czasie rzeczywistym specyficzną dla danego locus. W tym przykładzie ekspresja genu obronnego ANA PR two Arabidopsis została indukowana przez benzo-diazole, syntetyczny analog fitohormonu kwasu salicylowego. Wyniki wykazują, że aktywacja ekspresji PR two wiąże się ze wzrostem acetylacji reszt lizyny w histonach H3 i H4 w obrębie promotora PR two.</p><p>Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że dodanie pierwszego buforu ekstrakcyjnego do proszku z liści powoduje wzrost ciśnienia w zamkniętej probówce typu fcon. Należy pamiętać o okresowym otwieraniu probówki. Ponadto nie wolno wyjmować pędzelka po zawieszeniu osadów, a przed dodaniem kolejnego buforu.</p><p>Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak określać modyfikacje histonów i poziomy ich występowania, wykorzystując sieciowanie DNA i histonów oparte na formaldehydzie, izolację poprzez immunoprecypitację chromatyny oraz ilościowe oznaczanie DNA w konkretnych loci, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące roli chromatyny i jej modyfikacji w różnych dziedzinach biologii roślin.</p>

detection-of-histone-modifications-in-plant-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u <em>Arabidopsis</em>

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis <em>in vivo</em>

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w <em>Magnaporthe oryzae</em>

Szczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&amp;Tag) to skuteczna strategia profilowania epigenomicznego chromatyny. Protokół ten przedstawia udoskonaloną strategię CUT&amp;Tag do profilowania modyfikacji histonów w roślinach.

Profilowanie modyfikacji H3K4me3 w roślinach przy użyciu rozszczepienia w ramach celów i tagowania

Ten protokół opisuje, jak trójwymiarowy system hodowli komórkowej może być używany do modelowania, leczenia i analizowania modyfikacji chromatyny w stanie zbliżonym do fizjologicznego.

Kwantyfikacja na poziomie globalnym modyfikacji potranslacyjnych histonów w modelu 3D hodowli komórkowej tkanki wątrobowej

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi <em>in vivo</em> poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj metodę wykrywania modyfikacji histonów w liściach roślin za pomocą chromatynowej immunoprecypitacji i PCR w czasie rzeczywistym. Technika ta pozwala badać regulację ekspresji genów u Arabidopsis.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Przeglądaj więcej filmów