Metoda leczenia komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości soli i ich adoptywnego transferu do myszy

Rozpocząć od płytki wielodołkowej zawierającej zawiesinę komórek dendrytycznych lub DC.

Aby naśladować stan nadciśnieniowy, dodaj pożywkę hodowlaną zawierającą wysokie stężenie jonów sodu i inkubuj.

Podczas inkubacji jony sodu dostają się do komórki, zwiększając wewnątrzkomórkowe stężenie sodu.

Powoduje to wymianę wewnątrzkomórkowych jonów sodu z zewnątrzkomórkowymi jonami wapnia.

Zwiększony wewnętrzny poziom wapnia aktywuje szlaki, które ułatwiają wytwarzanie reaktywnych aldehydów, które wiążą się z białkami komórkowymi. To aktywuje DC, które wyświetlają te zmodyfikowane białka na swojej powierzchni.

Po inkubacji zebrać komórki do probówki i odwirować.

Usunąć supernatant. Dodaj nowy bufor, aby ponownie zawiesić komórki.

Pobrać zawiesinę komórek do strzykawki.

Weź znieczuloną mysz i wstrzyknij zawiesinę komórkową zadoczodołowo, która jest obszarem za oczodołem.

Ten proces wstrzykiwania aktywowanych komórek odpornościowych nazywa się adoptywnym transferem komórek.

Odpipetować 900 mikrolitrów zawiesiny DC do 24-dołkowej płaskiej płytki sokoła z płaskim dnem. Dodać 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej prądu stałego o wysokiej zawartości soli do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie sodu 190 milimolów. Oznacz płytkę i umieść ją w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Po 48 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora. Wytrzyj pożywkę do hodowli komórkowej w jednym dołku w górę iw dół, aby ponownie zawiesić CD11c-dodatnie DC. Przenieś całą zawiesinę do odpowiedniej oznakowanej probówki o pojemności 1,6 mililitra. Powtórz to dla każdej pojedynczej studzienki, która została platerowana.

Odwirować wszystkie probówki w temperaturze 300 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad prądu stałego za pomocą 100 mikrolitrów sterylnego DPBS. Następnie pobierz roztwór prądu stałego z jednej z probówek do 1-mililitrowej strzykawki wyposażonej w półcalową igłę o rozmiarze 27 rozmiarów.

Umieść naiwnego, 10-tygodniowego, czarnego sześcioosobowego samca myszy C57 poniżej 2% izofluranu, aby uzyskać stabilną płaszczyznę chirurgiczną. Sprawdź poziom znieczulenia przy braku odruchu pedałowania. Po uzyskaniu stabilnej płaszczyzny operacyjnej powoli i ostrożnie wprowadź igłę do przestrzeni zadoczodołowej pod kątem około 30 stopni.

Powoli i płynnie wstrzyknij zawiesinę DC CD11c-dodatnią. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy ostrożnie wyjąć igłę z miejsca zadoczodołowego, uważając, aby nie uszkodzić oka. Następnie wyjmij myszy ze stożka nosowego i monitoruj je przez około 30 minut podczas rekonwalescencji po znieczuleniu.